顏家琦，王思齊，王 崢，李 雋

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

肝臟是全身代謝的關(guān)鍵器官[1],當(dāng)肝臟功能受損時,可能引發(fā)胰島素抵抗,進而導(dǎo)致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)等代謝性疾病[2]。糖尿病患者的特征為血糖升高,其主要原因是糖異生作用增強。此外,肝臟脂質(zhì)蓄積或脂質(zhì)代謝紊亂會進一步干擾胰島素敏感性,進而加重T2DM的發(fā)生[3]。在當(dāng)今飲食方式和社會環(huán)境的影響下, T2DM全球發(fā)病率一直呈上升趨勢,據(jù)估計,到2030年糖尿病患病率將增長至10.2%[4]。糖尿病人群的激增造成了國家醫(yī)療和經(jīng)濟的雙重壓力,且目前沒有有效的臨床治愈手段,因此探索治療T2DM的有效方法成為一個亟待解決的科學(xué)問題。

黃連是一種傳統(tǒng)中藥,歷代醫(yī)書對于應(yīng)用黃連治療糖尿病有著大量的記載?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃連具有多種治療活性[6],包括抗菌消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、降血壓和抗氧化等作用[7]。黃連生物堿(coptis alkaloids, CA)是中藥黃連的主要藥理活性成分,目前對其治療糖尿病的具體生物堿成分及作用機制尚不清楚。根據(jù)黃連樣品HPLC圖譜分析可知,黃連生物堿中主要單體成分包括小檗堿(Ber)、表小檗堿(Epiber)、黃連堿(Cop)、巴馬汀(Palm)、藥根堿(Jateo)、非洲防己堿(Colum)和木蘭花堿(Magno)7 種[8]。本研究使用小鼠原代肝細胞建立糖異生模型與脂質(zhì)蓄積模型,篩選能改善小鼠原代肝細胞糖異生與脂質(zhì)蓄積的黃連生物堿單體成分,并探討其作用機制,為其用于防治代謝性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:黃連總生物堿、黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、木蘭花堿(成都曼斯特生物科技公司);DMEM培養(yǎng)基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);Ⅳ型膠原酶(Sigma公司);CCK-8試劑盒(北京聚地安泰科技有限公司);葡萄糖檢測試劑盒(碧云天公司);Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR反應(yīng)預(yù)混液(南京諾唯贊公司);考馬斯亮藍G250(北京索萊寶科技有限公司);GAPDH抗體(Millipore公司);p-AKT、AKT、FAS、PPARγ抗體(CST公司);PLIN1抗體(Abclonal公司);山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

1.1.2 溶液配方:緩沖液Ⅰ(142 mmol/L氯化鈉,6.7 mmol/L氯化鉀,10 mmol/L HEPES, 0.95 g/L EGTA,pH 7.4);緩沖液Ⅱ(66.7 mmol/L氯化鈉,6.7 mmol/L氯化鉀,100 mmol/L HEPES,4.8 mmol/L二水氯化鈣,0.5 g/L Ⅳ型膠原酶,4.2 g/L FFA-free BAS,pH 7.6);緩沖液Ⅲ(90% Percoll,10% PBS,10 mmol/L HEPES,pH 7.4±0.2)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝細胞的提取:給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉,分別使用緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ進行肝臟灌流。摘取肝臟放入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,在超凈臺內(nèi)快速抖落細胞,并將細胞懸液通過70 μm細胞篩。4 ℃、800 r/min 離心4 min,使用含7 mL緩沖液Ⅲ和8 mL培養(yǎng)基的混合液重懸細胞。4 ℃、1300 r/min離心5 min,用10 mL培養(yǎng)基重懸細胞,計數(shù)后接種至孔板中,4～6 h后換液。

1.2.2 CCK-8法測定細胞存活率:小鼠原代肝細胞貼壁換液后,分別加入0.5、1、2、5、10 μg/mL黃連總生物堿,或2.5、5、10、20 μmol/L單體成分處理24 h。棄掉上清,每孔加入90 μL細胞培養(yǎng)基和10 μL CCK-8的混合液,37 ℃避光孵育1 h,然后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。以對照組細胞的細胞存活率為100%,計算各實驗組的細胞存活率。

1.2.3 葡萄糖生成量的檢測:用低糖DMEM饑餓小鼠原代肝細胞3 h,換為無糖無酚紅DMEM。給藥組加入0.5、1、2 μg/mL黃連總生物堿,對照組與模型組加入等量DMSO。給藥1 h后,給藥組與模型組加入丙酮酸鈉(2 mmol/L)、乳酸鈉(20 mmol/L)以及胰高血糖素(100 nmol/L)。6 h后取上清,用葡萄糖檢測試劑盒(O-toluidine法)測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量。收取細胞,裂解后測定蛋白含量,以校正葡萄糖含量。

1.2.4 實時定量PCR檢測糖異生相關(guān)基因mRNA表達水平:收集各組細胞樣品,采用Trizol法提取總RNA,利用Nanodrop Lite超微量分光光度計進行定量,取1 μg總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以PPIA為內(nèi)參基因,利用SYRB Green法進行real-time qPCR檢測,計算目的基因的相對表達量。各目的基因的上下游引物如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers sequence for RT-qPCR

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平:收集各組細胞樣品,加入Triton-X 100裂解液,4 ℃裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清至離心管中,蛋白定量后加入上樣緩沖液混勻,95 ℃加熱5 min使蛋白變性,進行SDS-PAGE電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)印后,將膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,之后再加入一抗于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后,加入二抗室溫孵育1 h,使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并分析結(jié)果。

1.2.6 油紅O染色:給藥組加入0.5、1、2 μg/mL黃連總生物堿,對照組與模型組加入等量DMSO。給藥1 h后,給藥組與模型組加入棕櫚酸(0.5 mmol/L)和油酸(1 mmol/L)。48 h后棄去培養(yǎng)基,PBS清洗后用4%多聚甲醛室溫固定20～30 min。提前按照油紅O∶蒸餾水=3∶2配制油紅O工作液,過濾后使用(油紅O工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配)。棄去固定液后加入PBS清洗,吸干PBS,加入油紅O工作液,于室溫搖床上避光染色30 min。棄去染色液,PBS沖洗1遍,用60 %異丙醇沖洗2次,PBS清洗1次,干燥后拍照。每孔加入1 mL異丙醇將油紅O充分溶解,吸取100 μL加入黑色透明底96孔板中,使用酶標(biāo)儀測定510 nm處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃連總生物堿抑制胰高血糖素誘導(dǎo)的小鼠原代肝細胞糖異生

黃連總生物堿濃度為0.5、1、2 μg/mL時,小鼠原代肝細胞的細胞存活率在80%以上(圖1A),選用該劑量進行后續(xù)研究。糖異生模型組的葡萄糖生成量顯著高于對照組(P<0.001),且糖異生相關(guān)基因G6PC與PCX的mRNA表達水平也明顯高于對照組(P<0.05),使用黃連總生物堿處理后,葡萄糖生成量以及G6PC與PCX的mRNA表達水平均顯著低于模型組(P<0.05)(圖1B,C)。

A.detection of cytotoxicity of coptis alkaloids in mouse primary hepatocytes; B.coptis alkaloids decreased glucose production; C.coptis alkaloids decreased G6PC and PCX mRNA levels; *P<0.05, **P<0.001 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.001 compared with model group; C.control; M.model; CA.coptis alkaloids.圖1 黃連總生物堿對小鼠原代肝細胞的葡萄糖生成以及G6PC、PCX mRNA水平的影響Fig 1 Effects of coptis alkaloids on glucose production and G6PC, PCX mRNA levels in mouse primary

圖2 黃連生物堿單體成分對小鼠原代肝細胞中細胞存活率的影響Fig 2 Effects of coptis chinensis monomer on cell viability in mouse primary hepatocytes n=3)

2.2 不同劑量的黃連生物堿單體成分在小鼠原代肝細胞中的細胞存活率檢測

黃連堿與小檗堿濃度為2.5、5 μmol/L,表小檗堿、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、木蘭花堿濃度為2.5～20 μmol/L時,小鼠原代肝細胞的細胞存活率在80%以上,選用相應(yīng)藥物劑量進行后續(xù)研究。

2.3 小檗堿是有效抑制小鼠原代肝細胞糖異生的黃連生物堿單體成分

糖異生模型組的葡萄糖生成量顯著高于對照組(P<0.05),使用小檗堿處理后,葡萄糖生成量顯著低于模型組(P<0.05),其他單體藥物沒有降低小鼠原代肝細胞葡萄糖生成的作用(圖3A)。模型組糖異生相關(guān)基因G6PC與PCX的mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05),使用小檗堿處理后,G6PC與PCX的mRNA水平均顯著低于模型組(P<0.05)(圖3B)。胰高血糖素可導(dǎo)致AKT的磷酸化水平下調(diào)(P<0.05),不同劑量的小檗堿處理后,可以有效上調(diào)AKT的磷酸化水平(P<0.05)(圖3C)。

A.glucose production after treated with 7 types of coptis chinensis monomers for 6 hours; B.berberine decreased G6PC and PCX mRNA levels; C.berberine increased protein level of p-AKT;*P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; C.control; M.model.圖3 黃連生物堿單體成分對小鼠原代肝細胞糖異生的影響Fig 3 Effects of coptis chinensis monomer on gluconeogenesis in mouse primary hepatocytes n=3)

2.4 黃連總生物堿減少棕櫚酸與油酸誘導(dǎo)的小鼠原代肝細胞脂質(zhì)蓄積

脂質(zhì)蓄積模型組的紅色脂滴較對照組明顯增多(P<0.01),使用黃連總生物堿處理后,小鼠原代肝細胞中紅色脂滴的含量隨著藥物劑量的增加呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢,且與模型組相比脂滴變小,顏色變淺(P<0.01)(圖4A,B)。棕櫚酸與油酸處理可導(dǎo)致FAS、PLIN1的蛋白水平較對照組上調(diào)(P<0.01),不同劑量的黃連總生物堿處理后,可以劑量依賴性地下調(diào)FAS、PLIN1的蛋白水平(P<0.01)(圖4C)。

A.Oil red O staining of primary hepatocytes after treated with coptis alkaloids for 48 hours; B.quantification of oil red O staining; C.coptis alkaloids decreased protein level of FAS and PLIN1; *P<0.01 compared with control group; #P<0.01, ##P<0.001, ###P<0.0001 compared with model group.C.control; M.model; CA.coptis alkaloids.圖4 黃連總生物堿對小鼠原代肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響Fig 4 Effect of coptis alkaloids on lipid accumulation in mouse primary hepatocytes n=3)

2.5 黃連堿與小檗堿是有效抑制小鼠原代肝細胞脂質(zhì)積累的黃連生物堿單體成分

脂質(zhì)蓄積模型組的脂質(zhì)含量較對照組明顯增多(P<0.01),使用黃連堿與小檗堿處理后,小鼠原代肝細胞中脂質(zhì)含量隨著藥物劑量的增加呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(P<0.05),其他單體成分沒有減少小鼠原代肝細胞脂質(zhì)蓄積的作用(圖5A)。棕櫚酸與油酸處理可以導(dǎo)致FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平較對照組增加(P<0.01),不同劑量的黃連堿與小檗堿處理后,可以劑量依賴性地下調(diào)FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平(P<0.05)(圖5B)。

A.quantification of oil red O staining after treated with 7 types of coptis chinensis monomers for 48 hours; B.coptisine and berberine decreased protein level of FAS, PLIN1, PPARγ; *P<0.01 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with model group.C.control; M.model.圖5 黃連生物堿單體成分對小鼠原代肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響Fig 5 Effect of coptis chinensis monomer on lipid accumulation in mouse primary hepatocytes n=3)

3 討論

肝臟是機體代謝的主要器官,原代肝細胞是體內(nèi)肝細胞的良好代表,新分離的肝細胞比肝臟來源的細胞系更能反映正常肝臟在體內(nèi)的功能[9]。因此本研究使用小鼠原代肝細胞構(gòu)建糖異生模型與脂質(zhì)蓄積模型,用于后續(xù)研究。使用胰高血糖素處理是構(gòu)建糖異生模型的常見方法[9],在本研究中,胰高血糖素同樣可以升高小鼠原代肝細胞的葡萄糖生成,以及糖異生相關(guān)基因G6PC與PCX的mRNA表達水平,表明糖異生模型構(gòu)建成功,為進一步篩選改善糖異生的黃連生物堿單體成分及探討其作用機制奠定了良好基礎(chǔ)。

黃連作為一種應(yīng)用廣泛的中藥材,在治療糖尿病和NAFLD等代謝性疾病中發(fā)揮了重要作用,但其調(diào)節(jié)糖脂代謝的具體藥效成分及其作用機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可以抑制糖異生模型組的葡萄糖生成,同時降低G6PC與PCX的mRNA水平,進一步研究表明小檗堿通過上調(diào)AKT的磷酸化水平,從而降低小鼠原代肝細胞糖異生。此外,肝臟中脂質(zhì)代謝紊亂會加重T2DM的發(fā)生,肝臟脂質(zhì)蓄積嚴重可能導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH),甚至造成肝硬化和肝細胞癌,對人們的生命健康造成極大威脅[10-11]。本研究使用油酸與棕櫚酸構(gòu)建小鼠原代肝細胞脂質(zhì)蓄積模型,結(jié)果證實模型組細胞中的脂質(zhì)含量較對照組明顯增加,表明脂質(zhì)蓄積模型構(gòu)建成功;使用黃連堿與小檗堿處理后,小鼠原代肝細胞的脂質(zhì)含量較模型組減少,且FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平降低,表明黃連堿與小檗堿可以有效降低小鼠原代肝細胞的脂質(zhì)蓄積。

綜上所述,本研究構(gòu)建了小鼠原代肝細胞糖異生模型與脂質(zhì)蓄積模型,并成功篩選到能抑制原代肝細胞糖異生與脂質(zhì)蓄積的黃連生物堿單體成分。其中小檗堿通過調(diào)節(jié)AKT磷酸化水平從而降低小鼠原代肝細胞糖異生,此外,黃連堿與小檗堿可抑制FAS、PLIN1、PPARγ等脂質(zhì)生成相關(guān)蛋白的表達,進而減少小鼠原代肝細胞的脂質(zhì)蓄積,提示小檗堿與黃連堿在代謝性疾病的防治中具有良好的應(yīng)用前景。