蘇靚譽，張振西，杜文靜，2*

1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 細胞生物學系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005；2.山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 細胞生理學教育部重點實驗室，山西 太原 030606

胰腺癌在中國是致死人數(shù)第六的惡性腫瘤,由于其早期病情隱匿,超80%患者確診時已處于晚期,并且有推測到2030年它將成為美國腫瘤患者死亡的第二大原因[1]。目前無論是手術還是藥物治療的效果都不盡如人意,因此尋求胰腺癌的早期診斷手段及更有效的治療方法迫在眉睫。

Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)是一種微管相關蛋白[2]。有研究發(fā)現(xiàn),TPX2調控膠質瘤細胞的增殖、凋亡和有氧糖酵解[3],作為一個糖酵解相關基因,它還對前列腺癌[4]、結直腸癌[5]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極其重要的作用。而TPX2在胰腺癌的作用還未被系統(tǒng)分析。

Warburg效應是腫瘤細胞區(qū)別于正常組織細胞的代謝差異——即使在氧氣充足的條件下也會偏向使用糖酵解作用來取代正常細胞的有氧循環(huán)[6],本研究的目標是探索糖酵解在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用的基因,從而對其診療發(fā)揮作用。本研究對胰腺癌患者的糖酵解代謝特征進行綜合評價,發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者存在顯著的代謝差異,高速率糖酵解代謝隊列預后較差?；诟?、低代謝亞群的差異表達基因,發(fā)現(xiàn)關鍵預后基因TPX2,經(jīng)綜合分析發(fā)現(xiàn)TPX2的高表達與胰腺癌的發(fā)展及不良預后相關, TPX2有望成為胰腺癌預后預測的潛在標志性基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源:原始數(shù)據(jù)均從TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)和GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載。200個糖酵解相關基因從MSigDB數(shù)據(jù)庫[GSEA/MSigDB(gsea-msigdb.org)]下載。

1.1.2 細胞系:Bxpc-3人原位胰腺癌細胞系(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.3 主要試劑:干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)(上海吉瑪制藥技術有限公司): TPX2#1:5′-GCCUUUCAACCUGUCCCAATT-3;TPX2#2:5′-GGAGCUCGAGAAAUUGCAATT-3′;1640培養(yǎng)基(北京細工生物科技有限公司); 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone公司);Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 預后相關hub基因的探索:基于TCGA-PAAD數(shù)據(jù)集樣本的RNA-seq數(shù)據(jù),利用MSigDB數(shù)據(jù)庫下載的“HALLMARK_GLYCOLYSIS” 糖酵解代謝特征的包含200個基因的基因集,基于GSVA算法進行富集評分,根據(jù)分數(shù)的高低,樣本被分為3組,得分前25%的為up組,最后25%的down組及余下中間水平50%的zz組。隨后使用R包“Survminer”V0.4.9和“Survival”V3.2-13進行Kaplan-Meier分析和對數(shù)等級檢驗(P<0.05)比較兩組患者的總生存期(overall survival, OS)。R中的“Limma”包v3.48.3被用來分析up組和down組的差異基因表達,篩選差異表達基因的標準包括|log2(FC)|>1和FDR<0.05。分析的結果用R中的“ggplot2”v3.3.5程序包繪制成火山圖。差異基因通過GO功能富集分析和KEGG通路分析,結果可視化用R包“clusterProfiler” v4.0.5和“enrichplot” v1.12.2(P<0.05,q<0.05)。采用單因素Cox回歸分析(顯著水平:P<0.05)評估胰腺癌患者中差異基因的表達水平與OS的相關性,使用R中的“glmnet”軟件包v4.1-2進行最小絕對收縮和選擇算子(Lasso)回歸分析,以避免過度擬合。多因素Cox回歸分析(顯著性水平:P<0.05),確定差異基因與OS的相關性。

1.2.2 TPX2的表達與預后分析:GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/analysis)用于比較TPX2在胰腺癌及對應正常組織中的表達及其預后價值。GEPIA數(shù)據(jù)庫是一個在線網(wǎng)站,其分析的腫瘤和正常組織數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫。使用GEPIA數(shù)據(jù)庫探索TPX2的表達與胰腺癌患者的OS,在GEPIA數(shù)據(jù)庫中,TPX2表達的中位數(shù)被用作分組的分界值。Kaplan-Meier繪圖通過自動計算最佳分界值來對組進行分類。The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)用于比較TPX2在胰腺癌及正常組織中的免疫組化染色數(shù)據(jù)。

1.2.3 細胞的培養(yǎng)與轉染:細胞培養(yǎng)使用1640培養(yǎng)基+10%FBS,在5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。按照說明書使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑轉染siRNA到細胞中。

1.2.4 細胞計數(shù)實驗:細胞轉染siRNA 48 h后,重新接種4×104/孔的細胞于24孔板,加入500 μL的 1640完全培養(yǎng)基,每24 h取每組3個重復進行細胞計數(shù),計數(shù)7 d細胞數(shù)據(jù)即可繪制細胞曲線。

1.2.5 集落形成實驗:細胞轉染siRNA 48 h后,重新接種800個/孔的細胞于6孔板,加入2 mL完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)7天后甲醇固定細胞15 min,0.05%結晶紫染色15 min,蒸餾水洗凈后拍照。

1.2.6 CCK8檢測細胞增殖:細胞轉染siRNA 48 h后,重新接種于96孔板,每孔5×103個細胞,1640完全培養(yǎng)基體積100 μL,每組5個復孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入10 μL CCK8和90 μL 1640完全培養(yǎng)基,另取3個無細胞并加入等量試劑和培養(yǎng)基作為空白對照孔,培養(yǎng)箱中靜置2 h后檢測,隨后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并于48 h、72 h重復檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 糖酵解相關基因評分的分組分析

3個分組生存分析結果顯示down組相較于up組和zz組患者的預后顯著改善,up組的總體存活率較低(圖1A)。主成分分析(PCA analysis)表明不同的評分分組在維度上存在明顯差異(圖1B);熱圖顯示基因表達存在顯著差異,并且大多數(shù)基因上調存在于up組中(圖1C)。以上結果證明分組合理,組間存在差異。

A.survival analysis of three different score groups in patients with pancreatic ductal carcinoma (PAAD) from TCGA; B.PCA of transcriptome spectrum in high and low score groups; C.visual heat map of gene expression level in two groups.圖1 糖酵解基因集的富集分群Fig 1 Accumulation and clustering of glycolysis genes

2.2 差異基因的富集分析

糖酵解得分分組之間生存期存在顯著差異,為確定引起差異的基因, 分析up組和down組的基因表達數(shù)據(jù)(圖2A),這些差異基因(DEGs)可能是影響胰腺癌預后的關鍵基因。通過差異基因GO富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要富集在膜電位調節(jié)、神經(jīng)突觸相關以及細胞信號轉導相關生物過程(圖2B)。KEGG分析顯示,這些DEGs主要涉及MAPK信號通路等信號轉導相關途徑(圖2C)。

A.volcanic map of differentially expressed genes (P<0.05, q< 0.05); B.GO enrichment analysis of differential genes (P<0.05, q< 0.05); C.enrichment analysis of differential genes by KEGG pathway(P<0.05,q< 0.05).圖2 差異基因富集分析Fig 2 Differential gene enrichment analysis

2.3 風險模型的開發(fā)和驗證

基于最小似然偏差對識別出的差異基因進行Lasso回歸分析(圖 3A),5個基因(ANLN、TPX2等)的組合獲得了最佳性能(圖3B),多變量Cox分析進一步顯示,其中兩個基因(ANLN、TPX2)對于PAAD患者的生存具有獨立的預測作用(圖3C)。

A.the trend chart of lasso coefficients of differential genes in univariate Cox regression analysis; B.λ is obtained through the combination of at least five genes; C.multivariate Cox analysis of the screened genes showed that both genes were possible risk factors; D.survival analysis of low risk and high risk groups in TCGA data set; E.ROC curve for predicting prognosis in TCGA data set; F.survival analysis of low-risk and high-risk groups in GEO validation data sets; G.GEO validates the ROC curve for predicting prognosis in the data set.圖3 風險模型的構建和驗證Fig 3 Development and verification of risk model

本研究重點分析TPX2,根據(jù)風險模型中風險得分的中位數(shù),將TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫中PAAD患者分別分為低風險組和高風險組。Kaplan-Meier曲線顯示,無論是TCGA隊列(圖3D)還是GEO隊列(圖3E),低風險組比高風險組患者具有顯著的生存優(yōu)勢。TCGA(圖3F)和GEO(圖3G)隊列預測1、3、5年生存期的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.812、0.743、0.765和0.619、0.752、0.887,該模型在預測PAAD患者總體生存期方面具有良好的性能。

2.4 胰腺癌中TPX2的表達水平及預后

對比TPX2在正常組織和腫瘤組織的表達水平,GEPIA數(shù)據(jù)庫分析的結果顯示TPX2在PAAD中的表達顯著高于相對應的正常組織,而 TPX2低表達患者組預后顯著良好(圖4A,B)。The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫的免疫組化數(shù)據(jù)進一步驗證,胰腺癌腫瘤組織中TPX2的表達水平確實顯著高于正常胰腺組織(圖 4C,D)。

A.expression of TPX2 in normal and tumor tissues, *P<0.05 compared with normal group; B.OS of PAAD patients with high and low TPX2 expression; C,D.immunohistochemistry of pancreatic tumors (C) and corresponding normal tissues(D).圖4 胰腺癌中TPX2的表達及預后Fig 4 Expression and prognosis of TPX2 in pancreatic carcinoma

2.5 TPX2影響胰腺癌細胞增殖和糖酵解代謝

細胞水平實驗結果顯示siTPX2組的 CCK-8、克隆形成及細胞計數(shù)相比對照組細胞增殖活性顯著降低(圖5A～C);細胞增殖相關的基因CDK1、CDK2、CCNE1等的表達水平也隨之降低(圖5D)。qPCR檢測糖酵解代謝關鍵酶基因, siTPX2組中PKM2、PFKM、PGAM1等基因也顯著下調(圖5E)。

3 討論

本研究為TPX2提供了新的見解——可能成為胰腺癌患者生存和預后的潛在標志物,有望成為胰腺癌新的診療靶點。本研究構建的風險模型表明TPX2是胰腺癌的預后因素,此外TPX2的下調減少了胰腺癌細胞在體外的增殖,同時還減弱了胰腺癌細胞的有氧糖酵解。

TPX2作為一種微管蛋白,在有絲分裂紡錘體形成的過程中發(fā)揮重要的作用[7],TPX2在多種人類腫瘤中呈高表達,其被證明可以增強多種腫瘤的惡性特征。例如,TPX2促進了人乳腺癌細胞的遷移和侵襲[8];在神經(jīng)母細胞瘤中,TPX2被發(fā)現(xiàn)促進了腫瘤的增殖且可作為其預后標志[9];目前還未有研究評估TPX2表達與胰腺癌的關系,本研究發(fā)現(xiàn)TPX2與胰腺癌預后、細胞增殖及相關基因以及糖酵解相關基因相關。胰腺癌微環(huán)境與腫瘤細胞之間存在復雜的代謝相互作用,有研究表明,大多數(shù)與有氧糖酵解相關的酶在胰腺在未發(fā)生病變時低表達,而在原發(fā)及轉移腫瘤中高表達,說明胰腺癌對糖酵解有一定的依賴性[10]。在本研究中,敲降TPX2后,糖酵解相關基因的表達下調,細胞增殖相關指標也發(fā)生了下降,推測TPX2可能通過影響胰腺癌細胞的糖酵解代謝,從而影響細胞增殖,但這一點尚需進一步研究。隨著TPX2在胰腺癌調控機制的深入研究,TPX2有望成為胰腺癌診療的新靶點。