朱 建，楊 燕，徐淑楠，高 娜，康品方，王洪巨

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蚌埠 233004）

慢性低級別或持續(xù)性炎癥是原發(fā)性高血壓（es‐sential hypertension，EH）發(fā)展和維持的關(guān)鍵因素，免疫細(xì)胞如T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì) 胞 等 均 參 與 了 這 一 過 程［1‐5］。證 據(jù) 表 明，由 以NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）組成的炎癥體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［6］以及由其參與的經(jīng)典途徑介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［7］在EH 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。NLRP3 炎癥體通路受多種因素調(diào)控，其中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是該通路的活化劑，常被用于細(xì)胞及動物炎癥模型的建立以進(jìn)行相關(guān)研究［8］。前期以患病率較高的新疆哈薩克族EH患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)EH 患者NLRP3 炎癥體通路被活化［9，10］，然而該通路在EH 中的活化機(jī)制目前仍尚不十分清楚。

Pannexin‐1（Panx‐1）是 一 種 新 型 縫 隙 連 接 蛋白，在單個核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中均有廣泛表達(dá)［11］。研究表明，細(xì)胞外LPS 可以通過ATP 誘導(dǎo)P2X7R激 活，繼 而 活 化Panx‐1 通 道 而 在NLRP3 炎 癥 體 激活及IL‐1β 生成及釋放中均起到重要作用［12，13］。也有研究顯示，抑制Panx‐1 半通道功能可減少急性腎損傷中NLRP3 炎癥體活化及細(xì)胞凋亡［14］。然而，目前Panx‐1 蛋白在EH 發(fā)生發(fā)展中的作用報道較少。本研究擬通過明確Panx‐1 蛋白與EH 之間的相關(guān) 性，分 析Panx‐1 對NLRP3 炎 癥 體 通 路 及 其 介 導(dǎo)的單核細(xì)胞焦亡的影響，以探討EH 患者NLRP3 炎癥體通路的活化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

納入2021 年1 月～2021 年9 月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科門診就診且未經(jīng)降壓藥物治療的EH 患者50 例，定義為EH 組；選擇同時期健康體檢者50 例作為健康對照組，定義為NC 組。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國高血壓防治指南［15］。受試者直系親屬中任意一方有高血壓即認(rèn)為有高血壓家族史。吸煙定義為現(xiàn)在吸煙或已戒煙；飲酒定義為每周至少飲酒1 次，持續(xù)半年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)實驗室或臨床診斷為繼發(fā)性高血壓、先天性心臟及血管疾病、主動脈夾層、自身免疫性疾病、糖尿病、急慢性感染性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、有明確的血液系統(tǒng)疾病、有明確的惡性腫瘤病史。研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選對象均簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑與設(shè)備

IL‐1β ELISA 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，人淋巴細(xì)胞分離液及LPS 購自Sigma 公司，EasySep ?納米磁珠試劑盒及分選系統(tǒng)購自STEMCELL 公司，RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT‐qPCR 試劑盒均購自江蘇康為世紀(jì)公司，Panx‐1 兔多克隆抗體購自Abcam 公司，GSDMD 及GSDMD‐N 兔多克隆抗體購自Cell Signaling Tech‐nology 公司，NLRP3 兔多克隆抗體、ASC 兔多克隆抗 體、Caspase‐1 兔 多 克 隆 抗 體、內(nèi) 參GAPDH 兔 多克隆抗體、HRP 標(biāo)記的鼠抗兔二抗均購自Protein‐tech 公司，Cy3 標(biāo)記的熒光二抗購自Santa Cruz 公司，siRNA 片段由上海吉瑪公司合成，Lipo‐fectamine 2000 購 自Thermo Scientific 公 司，丙 磺 舒購自Selleck 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液、胎牛血清、OPTI 培養(yǎng)基購自Gibco 公司，ECL‐plus 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、熒光定量PCR 擴(kuò)增儀及Quality 圖像分析系統(tǒng)均產(chǎn)自Bio‐Rad 公司。

1.3 樣本及細(xì)胞收集

清晨采集所有受試者空腹外周靜脈血共約20 mL，肝素抗凝，2 500×g離心5 min 后收集上層血漿?80 ℃凍存?zhèn)溆?。采?Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，然后利用EasySep?納米磁珠試劑盒篩選CD14+單核細(xì)胞，所得的CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，計算CD14+細(xì)胞占比。獲取的CD14+單核細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 ELISA 檢測

嚴(yán)格按照ELISA 試劑說明書的步驟進(jìn)行操作，待檢測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均為復(fù)孔上樣，最后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm 處吸光值，求平均值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照得出的公式計算出對應(yīng)樣品血漿中的IL‐1β含量。

1.5 RNA 提取和qRT‐PCR

根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取單核細(xì)胞總RNA，取1 μg 進(jìn) 行 逆 轉(zhuǎn) 錄，反 應(yīng) 條 件：42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，獲得的cDNA 用于后續(xù)PCR 反應(yīng)。實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：SYBR Green ER qP‐CR Super Mix Universal（2×）12.5 μL，cDNA 模版0.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，ddH2O 11 μL，反應(yīng)總體積為 25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min，循環(huán)參數(shù) 95 ℃變性 30 s，退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共40 個循環(huán)，72 ℃ 5 min 終止反應(yīng)。利用Primer 3 軟件設(shè)計引物序列，由華大基因合成，以人β-actin為內(nèi)參，具體引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度見表1。擴(kuò)增結(jié)果采用 2‐ΔΔCt法分析。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.6 Western blot 檢測

提取單核細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白含量，每孔取20 μg 蛋白95 ℃變性后上樣，十二烷基硫酸鈉‐聚丙烯酰胺凝膠100 V、200 mA 電泳分離樣品蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用脫脂奶粉室溫封閉1 h，加 入 一 抗（Panx‐1，1∶2 000；NLRP3，1∶500；ASC，1∶5 000；Caspase‐1，1∶2 000；GSDMD，1∶1 000；GSDMD‐N，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000），置搖床4 ℃孵育過夜，經(jīng) PBST 洗膜3 次后加入二抗（1∶5 000），37 ℃孵育，室溫振搖2 h。洗膜后取5 mL 顯色液，按照顯色試劑說明書進(jìn)行顯色。用Quality 圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以GAPDH 的表達(dá)作為內(nèi)參照。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

經(jīng)免疫磁珠法分選獲得的單核細(xì)胞經(jīng)磁珠洗脫緩沖液洗滌后，以含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。LPS 及丙磺舒溶解于二甲基亞砜（DMSO）后，使用培養(yǎng)基配制細(xì)胞處理工作液。細(xì)胞分組及處理方法：（1）溶質(zhì)對照（Control）組：以含有0.1% DMSO 溶劑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）LPS 組：以含1 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；（3）LPS+NC siRNA 組：以含隨機(jī)無義siRNA 及Lipofectamine 2000 的無血清培養(yǎng)基（OPTI 培養(yǎng)基）干預(yù)12 h，再加入含LPS 的完全培養(yǎng)基干預(yù)6 h；（4）LPS +丙磺舒組：以含1 mg/mL丙磺舒的完全培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理12 h 后，再加入LPS 干預(yù)6 h；（5）LPS + Panx‐1 siRNA 組：以配置好 的 含Panx‐1 siRNA 及Lipofectamine 2000 的OP‐TI 培養(yǎng)基干預(yù)12 h，再加入含LPS 的完全培養(yǎng)基干預(yù)6 h。

1.8 免疫熒光檢測

單核細(xì)胞用PBS 漂洗3 次，用4%的多聚甲醛固 定15 min 后，經(jīng)PBS 漂 洗，加 入0.5% Triton X‐100 孵育20 min，再經(jīng)PBS 漂洗后，室溫封閉30 min，吸去封閉液，滴加一抗（Panx‐1，1∶200，以2%BSA 稀釋），4 ℃孵育過夜；棄去一抗，PBS 漂洗3次，滴加稀釋好的熒光二抗（1∶200，以2% BSA 稀釋），37 ℃孵育2 h，PBS 漂洗3 次，滴加DAPI 避光孵育5 min，洗去多余的DAPI，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.9 CCK‐8 檢測

將單核細(xì)胞經(jīng)計數(shù)后接種于96 孔培養(yǎng)板，5 000 細(xì)胞/100 μL/孔，培養(yǎng)過夜后，按上述分組方式設(shè)置復(fù)孔，再按照對應(yīng)組別加入100 μL 相應(yīng)藥物濃度2 倍的含藥培養(yǎng)基混合液，分別干預(yù)24 h，48 h，72 h 后，每孔再加入CCK‐8 試劑20 μL，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下各孔光吸收值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（±s）表示，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EH 組及NC 組受試者臨床基線信息

兩組受試者在年齡、吸煙、飲酒、高血壓家族史、體重指數(shù)、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05），兩組數(shù)據(jù)具有可比性，見表2。

表2 兩組人群臨床資料一覽表Tab 2 Clinical data of the two groups

2.2 兩組人群外周血漿中IL‐1β 含量對比

與NC 組相比，EH 組患者外周血漿中IL‐1β 含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 3.76，P<0.05），見圖1。

圖1 兩組外周血漿IL‐1β 表達(dá)水平比較Fig 1 The comparison of plasma IL-1β level between the two groups

2.3 人單核細(xì)胞的分選及驗證

EH 組及NC 組受試者外周血單個核細(xì)胞懸液經(jīng)免疫磁珠陽性分選法分離出單核細(xì)胞并經(jīng)流式鑒定，結(jié)果顯示分選得到的單核細(xì)胞懸液中CD14+細(xì)胞占比均大于90%，見圖2。

圖2 兩組CD14+人外周血單核細(xì)胞鑒定Fig 2 Flow cytometric identification of CD14+ monocytes in two groups

2.4 兩組人群外周血單核細(xì)胞上Panx‐1、NLRP3炎癥體相關(guān)分子及焦亡蛋白GSDMD 表達(dá)差異

如圖3A 所示，與NC 組相比，EH 組外周血單核細(xì) 胞 上Panx-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD的mRNA 表達(dá)水平均呈不同程度的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（t值分別為8.33、3.76、6.27、11.50、8.60、5.12，均P<0.05）。與此同時，EH 組外周血單核細(xì)胞上的Panx‐1 蛋白，NLRP3炎癥體相關(guān)分子（NLRP3、ASC、Caspase‐1和Cleaved‐Caspase‐1），以及焦亡蛋白GSDMD 和GSDMD‐N 的蛋白表達(dá)量，也較對照組均有明顯升高，見圖3B。

圖3 兩組人群單核細(xì)胞中Panx‐1、NLRP3 炎癥體相關(guān)分子和焦亡蛋白GSDMD 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平Fig 3 mRNA and protein expression of Panx-1，NLRP3 inflammasome related molecules，and pyroptosis-related proteinGSDMD on the monocytes of the two groups

2.5 免疫熒光染色觀察Panx‐1 蛋白在兩組人群單 核細(xì)胞上的表達(dá)及定位

將兩組人群分離并經(jīng)鑒定得到的單核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，Panx‐1蛋白表達(dá)在EH 組較NC 組明顯增加，且陽性表達(dá)的Panx‐1 蛋白主要定位于單核細(xì)胞膜上，見圖4。

圖4 兩組單核細(xì)胞上Panx‐1 蛋白的表達(dá)及定位Fig 4 Expression and localization of Panx-1 on mono-cytes of the two groups

2.6 體外細(xì)胞實驗調(diào)控Panx‐1 半通道功能對NL‐RP3 炎癥體及下游關(guān)鍵分子的表達(dá)影響

體外培養(yǎng)EH 組外周血單核細(xì)胞，并通過藥理學(xué)方法和分子生物學(xué)方法調(diào)控Panx‐1 半通道功能，繼而觀察NLRP3 炎癥體關(guān)鍵蛋白、效應(yīng)分子IL‐1β和焦亡蛋白GSDMD 的表達(dá)變化。Western blot 檢測篩選干擾效率較高的Panx‐1 siRNA 1，用于后續(xù)實驗（圖5A）。干預(yù)藥物及Panx‐1 siRNA、siRNA NC 對單核細(xì)胞的活力影響較?。▓D5B）。NLRP3炎癥體通路激活劑LPS 刺激單核細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上 清 中IL‐1β 含 量 顯 著 升 高（LPSvs.Control，t=4.04，P<0.05）；針對Panx‐1 特異性抑制劑丙磺舒及siRNA 均可以抑制LPS 的活化效應(yīng)（LPS+siRNA NCvs.LPS，t=0.62，P>0.05；LPS+Provs.LPS，t=3.54，P<0.05；LPS+Panx‐1 siRNAvs.LPS，t=3.81，P<0.05），見圖5C。在檢測單核細(xì)胞上各目的蛋白表達(dá)時，上述現(xiàn)象同樣存在，見圖5D。

圖5 抑制EH 患者單核細(xì)胞上Panx‐1 半通道功能對細(xì)胞活力及NLRP3 炎癥體通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響Fig 5 Effect of inhibition of Panx-1 hemi-channels on cell viability and expression of NLRP3 inflammasome related key molecules on the monocytes from EH patients

3 討論

研究表明，EH 患者外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）處 于 一 定 程 度 的 炎 癥 活 化 狀 態(tài)［16，17］。PBMCs 包括單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，是慢性炎癥的重要參與者，能分泌包括IL‐1β［18］、TNF‐α［19］、Interfer‐on‐γ［20］等在內(nèi)的多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)，介導(dǎo)EH慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展。炎癥體是先天免疫反應(yīng)的組成部分，其中由NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）、Caspase‐1 蛋白組成的蛋白復(fù)合體稱為NL‐RP3 炎癥體，NLRP3 受到外界刺激活化后，形成炎癥體剪切Caspase‐1 蛋白前體成為其活化形式Cleaved‐Caspase‐1，繼而介導(dǎo)IL‐1β 的成熟，成熟型IL‐1β 主要通過細(xì)胞焦亡釋放［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)哈薩克族EH 患者PBMCs 上表達(dá)NLRP3 炎癥體通路關(guān)鍵分子，并且處于激活狀態(tài)，表現(xiàn)為該通路關(guān)鍵蛋白NLRP3、Caspase‐1 及下游細(xì)胞因子等的表達(dá)明顯增加，提示該通路的激活可能與EH 炎癥機(jī)制有關(guān)［9，10］。同時，通過對慢性心力衰竭外周血漿及單核細(xì)胞進(jìn)行研究時也發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭患者單核細(xì)胞中NLRP3 炎癥體信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高并伴有炎癥活化，且該現(xiàn)象隨心力衰竭級別的加重而明顯［21］。由此可見，NLRP3 炎癥體信號通路以及由其產(chǎn)生的炎癥活化效應(yīng)與EH 及慢性心力衰竭這兩種常見心血管疾病均存在相關(guān)性。本研究進(jìn)一步以漢族EH 患者為研究對象，同樣發(fā)現(xiàn)EH患者外周血漿中IL‐1β 表達(dá)水平增高，并且外周血單核細(xì)胞上NLRP3 炎癥體關(guān)鍵分子及下游IL‐1β效應(yīng)因子的mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，表明NL‐RP3 炎癥體活化這一效應(yīng)在EH 患者中可能具有普適性，并不受民族差異的影響。

由NLRP3 炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是一種依賴于Caspase‐1 的細(xì)胞死亡類型，其特點是 GSDMD蛋白前體由活化的Caspase‐1 剪切折疊后形成活性GSDMD 蛋白（GSDMD‐N），從而在細(xì)胞膜上形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微孔，細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)可通過這些微孔從胞質(zhì)內(nèi)釋放到細(xì)胞外參與一系列炎癥信號傳導(dǎo)和炎癥效應(yīng)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)EH 患者外周血單核細(xì)胞上GSDMD 蛋白表達(dá)量也隨NLRP3/Caspase‐1發(fā)生一致的變化，且其剪切體GSDMD‐N 的變化趨勢更加顯著，這在一定程度上提示單核細(xì)胞上NL‐RP3 炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與EH 的發(fā)生相關(guān)。

基于NLRP3 炎癥體及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在EH 中的重要性，其活化機(jī)制值得進(jìn)一步探索。有研究提示Panx‐1 半通道的開放會導(dǎo)致鉀離子外流、鈣離子和大分子物質(zhì)（如ATP 等）跨膜流動導(dǎo)致細(xì)胞功能的變化，進(jìn)而活化NLRP3 炎癥體［23］。Panx‐1是Pannexin 蛋白家族的成員之一，廣泛表達(dá)于人體器官及血管內(nèi)皮組織中。它是與Connexin 和Innex‐in 家族不同的一種新型縫隙連接蛋白，可在細(xì)胞膜上形成半通道，并參與調(diào)節(jié)血管張力和血壓［24］。有研究發(fā)現(xiàn)Panx‐1 半通道可活化NLRP3 炎癥體介導(dǎo)的Caspase‐1 經(jīng)典途徑，從而在細(xì)胞焦亡中起到重要的作用［25］。

為了明確Panx‐1 半通道在EH 中的作用，首先通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測一致發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，EH 患者組外周血單核細(xì)胞上Panx‐1 的蛋白表達(dá)量明顯增加，并且表達(dá)的Panx‐1主要定位于細(xì)胞膜，有條件形成半通道，初步提示Panx‐1 及其形成的半通道可能與EH 的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步基于EH 患者來源的單核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用藥理學(xué)以及分子生物學(xué)方法干預(yù)細(xì)胞，在確認(rèn) NLRP3 通路激活劑LPS 可以活化NLRP3 炎癥體通路的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Panx‐1 半通道特異性抑制劑丙磺舒及特異性siRNA 均可以抑制LPS 的上述活化效應(yīng)，表現(xiàn)為單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL‐1β 含量被下調(diào)，NLRP3 炎癥體相關(guān)分子及IL‐1β、GSDMD的蛋白表達(dá)量亦均明顯下調(diào)。這些結(jié)果表明EH 患者NLRP3 炎癥體活化及其介導(dǎo)的單核細(xì)胞焦亡受Panx‐1 半通道功能的調(diào)控。

綜上，本研究通過選取EH 患者外周血原代單核細(xì)胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)該人群外周血單核細(xì)胞上NLRP3/Caspase‐1 的活化介導(dǎo)了單核細(xì)胞焦亡，而Panx‐1 蛋白的表達(dá)及功能變化參與對其調(diào)控。人外周血來源的原代單核細(xì)胞與人單核細(xì)胞系（如THP‐1）相比，其在體外增殖的穩(wěn)定性及重復(fù)性不如后者，但前者來源于臨床病例，在探討具體疾病的發(fā)生機(jī)制方面具有一定優(yōu)勢。因此，本研究有助于進(jìn)一步明晰EH 患者單核細(xì)胞上NLRP3 炎癥體通路活化的分子機(jī)制，進(jìn)一步豐富EH 炎癥機(jī)制信號網(wǎng)絡(luò)，提示未來以Panx‐1 蛋白及其半通道為靶點，可能為探尋更多EH 治療策略提供新思路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

朱建：主要實驗執(zhí)行、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫；楊燕、徐淑楠、高娜和康品方：協(xié)助實驗執(zhí)行、數(shù)據(jù)整理及分析；王洪巨：實驗設(shè)計指導(dǎo)與論文修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。