李嘉欣，邵文靜，張今杰，魏玉磊，蓋勝男，吳庚錦，劉仕緣，賀琳，李佐同，徐晶宇

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心，大慶 163319）

地球上各種生命活動(dòng)的維持都離不開光合作用，光合作用是維持生命活動(dòng)的根本化學(xué)反應(yīng)[1]。在許多植物中，類囊體膜是一種基本光合膜反射系統(tǒng)，植物在類囊體膜的光合膜上面就可以同時(shí)進(jìn)行各種不同光能的連續(xù)光合吸收、傳遞和進(jìn)行光能光合轉(zhuǎn)換[2]。脂質(zhì)雙層膜和（色素）蛋白復(fù)合體構(gòu)成了類囊體膜，其中最主要的就是多種構(gòu)成類囊體的雙層蛋白膜，按脂質(zhì)分為單半乳糖甘油二脂（monogalactosyldiacylglycerol、MGDG）、雙半乳糖甘油二脂（digalactosyl diacylglycerol，DGDG）、硫代異鼠李糖甘油二脂（sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）四種[3-4]。其中，含硫陰離子糖脂硫代異鼠李糖甘油二脂（sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG） 是由硫代異鼠李糖甘油二脂合酶（SQD）催化硫代異鼠李糖部分向二酰基甘油（DAG）轉(zhuǎn)移從而生成的光合膜上唯一在生理狀況下帶負(fù)電荷的糖脂（glycolipid），對(duì)正常生長(zhǎng)條件下的植物是必不可少的，尤其是在低磷脅迫中，它可以替代陰離子磷脂PG 維持類囊體膜的負(fù)電荷[5-6]。

目前，在模式植物擬南芥中已有2 個(gè)SQD基因被報(bào)道[5]。在擬南芥中，SQD1位于葉綠體基質(zhì)中并且可溶，而SQD2則位于葉綠體的內(nèi)膜[8-9]。在玉米基因組中，課題組鑒定出5 個(gè)SQD基因，并將擬南芥和玉米SQD基因分為TypeA 和TypeB 亞組：AtSQD1和ZmSQD1為TypeA 亞組；AtSQD2和ZmSQD2-5為TypeB 亞組[7]。在一個(gè)SQD蛋白成員家族中，A 型中的SQD蛋白成員和B 型中的SQD蛋白成員在保守結(jié)構(gòu)域上表現(xiàn)較出明顯的功能差異，這表明在A 型和B 型之間存在著潛在的蛋白質(zhì)功能分化差異[7]。

在擬南芥中，SQD2包含一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域，并催化最終反應(yīng)步驟SQDG生物合成途徑，它參與了磷酸鹽脅迫反應(yīng)[10-11]。目前已有研究證明玉米和擬南芥TypeB 基因在低磷脅迫下葉片和根中均有較高表達(dá)[12]。同時(shí)，已有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，低磷生長(zhǎng)條件下，sqd1和sqd2突變的擬南芥植株均生長(zhǎng)緩慢，但是只有sqd2突變的植株中的磷檢測(cè)能找到明顯的植物生長(zhǎng)功能缺陷以及新發(fā)現(xiàn)的陰離子糖醛酸苷二酰甘油（GlcADG）[13-14]。也有學(xué)者報(bào)道，低磷條件下，相比于野生型，細(xì)菌細(xì)胞中的一些缺乏硫脂的突變體更早的出現(xiàn)停止細(xì)胞生長(zhǎng)[15-17]。除此之外，亦有學(xué)者證明，水稻基因組包含三個(gè)SQD2基因（SQD2.1，SQD2.2和SQD2.3）[18-19]。Zhan 等[12-17]已通過水稻SQD2.1活性鑒定了一種特定的類黃酮糖苷，可減輕ROS 的氧化損傷并增強(qiáng)植物對(duì)鹽分和干旱脅迫的耐受性，此外，AtSQD2也參與調(diào)節(jié)水稻的糖代謝和結(jié)實(shí)。但在玉米中SQD基因功能的深入研究還未見報(bào)道。

研究通過克隆ZmSQD3基因的全長(zhǎng)分子序列、生物信息學(xué)分析以及表達(dá)模式分析來預(yù)測(cè)該基因的主要功能，研究ZmSQD3基因功能及其在玉米生長(zhǎng)過程中的關(guān)鍵作用，為ZmSQD3基因結(jié)構(gòu)功能探究及其他植物中SQD基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米（Zea MaysL.）自交系合344，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)玉米育種室提供。

1.2 ZmSQD3 基因克隆試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米葉片和根系總RNA 提取及cDNA 的獲得

將大小均勻、籽粒飽滿的種子用10%次氯酸鈉消毒，30 min 后用蒸餾水沖洗干凈，浸種8 h 催芽，放置于28 ℃下避光萌發(fā)。當(dāng)種子初生根根長(zhǎng)約1.5～2 cm 后，轉(zhuǎn)移至蒸餾水中，培養(yǎng)3 d 后，轉(zhuǎn)入富磷（+P：1 000 μM/L KH2PO4）的1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至二葉一心時(shí)期，將其中一組幼苗進(jìn)行低磷處理，即轉(zhuǎn)移到磷含量為5 μM/L KH2PO4（低磷）的營(yíng)養(yǎng)液中，同時(shí)處理組的營(yíng)養(yǎng)液加入與對(duì)照中KH2PO4等摩爾濃度的KCl，用以補(bǔ)齊K+濃度；調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液pH為6.0，每3 d 更換一次營(yíng)養(yǎng)液。將處理中的玉米放置于相對(duì)濕度為65%，每天光照時(shí)間16 h，光照條件為晝/夜溫度27 ℃/18 ℃的生長(zhǎng)條件中生長(zhǎng)。處理時(shí)間為1，3，7 d 時(shí)，在處理組和對(duì)照組中分別取玉米葉片及根系組織，取樣后迅速放入液氮中，通過磨樣機(jī)快速研磨成粉末狀，以Trizol 法提取玉米（合344）RNA，提取RNA 的步驟按照康寧生命科技有限公司的提取試劑盒（AxyPrep 試劑盒）說明書進(jìn)行操作，提取后用事先準(zhǔn)備好的DEPC 水進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行溶解（14 μL DEPC 水），通過1%瓊脂糖電泳對(duì)提取的RNA 進(jìn)行質(zhì)量性能優(yōu)化性檢測(cè)。參照反轉(zhuǎn)錄takara試劑盒中的操作說明對(duì)提取出來的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 在凝膠中驗(yàn)證，將cDNA在28 S 和18 S 條帶的亮度和寬度比例為2∶1 的結(jié)果cDNA 保存于-20 ℃，備用。

1.2.2ZmSQD3基因引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ZmSQD3基因在Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)（GRMZM2G477503）找到該基因CDS 序列，退火溫度60 ℃。去掉ZmSQD3下游的終止子，再在保守區(qū)內(nèi)進(jìn)行設(shè)計(jì)使其上下游基因引物在前端加入了經(jīng)過SmaI酶切的同源序列（表1）。以玉米cDNA 為模板進(jìn)行ZmSQD3基因片段的擴(kuò)增。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

表2 擴(kuò)增ZmSQD3 基因的PCR 反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of PCR for amplifying ZmSQD3 gene

表3 ZmSQD3 基因克隆反應(yīng)體系Table 3 The reaction system of ZmSQD3 gene cloning

表4 重組連接體系Table 4 Restructuring the connection system

1.2.3 目的基因PCR 擴(kuò)增

以玉米葉片總RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板，擴(kuò)增ZmSQD3基因，結(jié)合cDNA 全長(zhǎng)設(shè)置反應(yīng)程序，以下為PCR 的反應(yīng)序列體系：

在Eppendorf PCR 儀上設(shè)置PCR 程序如下：

4 ℃，保存PCR 產(chǎn)物。

1.2.4 TA 克隆

（1）向平末端DNA 片段3′末端加堿基A：

混勻后輕離心，72 ℃下在PCR 儀中保溫25 min；

（2）按照插入片段與載體摩爾比為6∶1 來計(jì)算DNA 的加入體積X μL，在冰上加入以下組分：

輕輕吸打，短暫離心；于16 ℃條件下過夜連接。

1.2.5 菌種保存、測(cè)序及分析

（1）保存菌種

將15 mL 離心管滅菌，在LB 液體培養(yǎng)基中加入5 mL 100 μg·mL-1Kana 抗生素，用無菌牙簽挑取少許陽(yáng)性單菌落，置于抗性培養(yǎng)液中，37 ℃、170 rpm 振蕩培養(yǎng)12 h；取2 只滅過菌的1.5 mL 離心管，依次加入滅好菌的200 μL 80%甘油及800 μL 菌液，充分混合，一只用于測(cè)序，另一只液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）測(cè)序及分析

選擇若干陽(yáng)性克隆的甘油菌送到上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行雙向測(cè)通的基因測(cè)序；得到測(cè)序結(jié)果后，通過DNAMAN 等軟件比較陽(yáng)性克隆序列與目標(biāo)序列的一致性，并確認(rèn)酶切位點(diǎn)與引物是否存在錯(cuò)位，挑選序列信息完全正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3 生物信息學(xué)分析

供試基因在不同環(huán)境脅迫中的表達(dá)數(shù)據(jù)來自于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。測(cè)序在BMK 測(cè)序平臺(tái)完成。主要分析方法見表5：

表5 生物信息學(xué)分析方法Table 5 Bioinformatics analysis method

1.4 表達(dá)模式分析

1.4.1 樣品處理及取樣

樣品處理見1.2.1，分別取鹽和低磷處理1，3，7 d的玉米幼苗葉片和根系相同部位，將樣品送至北京市百邁克公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后數(shù)據(jù)分析

為了確定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是否可以進(jìn)行后續(xù)的分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控（QC），去掉原始數(shù)據(jù)中質(zhì)控不合格的低質(zhì)量序列。然后將過濾后的clean reads 與玉米參考基因組（B73_RefGen_v3）進(jìn)行比較，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行第二次質(zhì)控（QC of alignment），通過比對(duì)率的統(tǒng)計(jì)分析和reads 在參考序列上的分布的方法來判斷是否通過第二次檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆鑒定

依據(jù)ZmSQD3基因ORF 的序列擴(kuò)展設(shè)計(jì)特異引物，用PCR 產(chǎn)物序列檢測(cè)引物特異性，結(jié)果表明，ZmSQD3基因擴(kuò)增后可產(chǎn)出序列大小為1 314 bp 的單一清晰特異性基因條帶（圖1），與預(yù)期克隆結(jié)果相符，且通過CDS 及其所編碼的氨基酸序列可知，Zm－SQD3基因共編碼437 個(gè)氨基酸（圖2）。

圖1 ZmSQD3 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR product of ZmSQD3 gene

圖2 ZmSQD3 基因的CDS 及其所編碼的氨基酸序列Fig.2 Complete CDS of maize SQD3 gene and its encoding amino acid sequence

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 物種間氨基酸序列比對(duì)

將玉米（Z.mays）的SQD3基因與通過NCBI 網(wǎng)站上下載得到的擬南芥（A.thaliana），水稻（O.sativa），高粱（S.bicolor），大豆（G.max）和短柄草（B.sylvaticum Beauv）SQD基因共15 個(gè)基因作系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ZmSQD3基因序列與高粱SQD3基因序列高度相似，相似度為92.62%，親緣關(guān)系最近。

圖3 ZmSQD3 基因同源進(jìn)化樹比對(duì)Fig.3 Comparison of homologous evolutionary trees of ZmSQD3 gene

2.2.2ZmSQD3基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI 網(wǎng)站中的BLAST 對(duì)全長(zhǎng)為1 314 bp的ZmSQD3基因進(jìn)行CDS 序列結(jié)構(gòu)及編碼蛋白質(zhì)的功能分析，結(jié)果表明，ZmSQD3基因?qū)儆赑LN02871家族成員（圖4），對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)顯示ZmSQD3基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量為437 個(gè)aa，相對(duì)分子量為49.23 kDa，等電點(diǎn)在6.85，分析ZmSQD3的氨基酸組成、正負(fù)電荷殘基、平均疏水性、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)和半衰期，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)40.33，超過閾值40。ZmSQD3蛋白為不穩(wěn)定堿性親水蛋白（表6、7）。

表6 ZmSQD3 氨基酸組成分析Table 6 Amino acid composition of ZmSQD3

表7 ZmSQD3 基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Table 7 Predictive analysis of the primary structure of the protein product encoded by the ZmSQD3 gene

2.2.3ZmSQD3基因編碼的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及親/疏水性分析

蛋白質(zhì)磷酸化轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的基因預(yù)測(cè)主要以一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析算法作為預(yù)測(cè)基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)ZmSQD3基因編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)。如圖5A，ZmSQD3蛋白存在36、84、97、101、106、120、157、166、174、208、217、225、245、294、307、319、322、347、381、392 共19 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；5 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別是66、284、351、367、378）；4 個(gè)潛在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別是40、91、150、400）。相應(yīng)的磷酸化勢(shì)位點(diǎn)如圖5B，分析表明3 種主要氨基酸結(jié)合激酶磷酸化且激活一個(gè)ZmSQD3蛋白最終調(diào)控整個(gè)基因組的表達(dá)。ZmSQD3基因預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)中的親、疏水性結(jié)果顯示親水性最大峰值是位于多肽鏈第343 位的甲基谷氨酸（對(duì)應(yīng)峰值：-2.444），疏水性最大峰值是位于第127 位的甲基脯氨酸（對(duì)應(yīng)峰值：2.767）。根據(jù)氨基酸分值的高低對(duì)應(yīng)親疏水性強(qiáng)弱的變化規(guī)律，親水性最強(qiáng)的氨基酸是該基因序列第127 位的脯氨酸，疏水性最強(qiáng)的氨基酸是該基因序列第343 位的谷氨酸，在氨基酸數(shù)量比對(duì)上，親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，并且在肽鏈中是均勻分布的；研究證明Zm－SQD3基因編碼蛋白質(zhì)為親水性結(jié)合蛋白（圖6）。

圖5 ZmSQD3 蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction results of potential phosphorylation sites of ZmSQD3 protein

圖6 ZmSQD3 蛋白質(zhì)親水和疏水性分析Fig.6 Hydrophilic and hydrophobic analysis of ZmSQD3 protein

2.2.4ZmSQD3基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由圖7，通過對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析得知，ZmSQD3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α 螺旋、不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、β 折疊以及β 轉(zhuǎn)角組成。其中α 螺旋占46.00%，不規(guī)則卷曲占14.19%，β 折疊占6.18%，β 轉(zhuǎn)角占33.64%。

圖7 ZmSQD3 基因編碼的蛋白產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 The secondary structure of the protein product encoded by the ZmSQD3 gene

2.2.5ZmSQD3基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用Phyre2 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析ZmSQD3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物并預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Rasmol 軟件分析玉米ZmSQD3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖8 可見，建?？尚哦确秶℅MQE）為0.52，大于0.4，區(qū)間（QMEAN）為-3.66 ，證明建模結(jié)果可信。

圖8 ZmSQD3 基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Tertiary structure of ZmSQD3 encoded protein

2.2.6ZmSQD3基因啟動(dòng)子序列分析

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載ZmSQD3基因ATG 上游5 000 bp 啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子序列提交至Plant－CARE 應(yīng)用程序中，預(yù)測(cè)ZmSQD3基因啟動(dòng)子區(qū)域所含主要啟動(dòng)子序列元件。由表8 可知，植物基因啟動(dòng)子響應(yīng)區(qū)域不僅分別存在ABA 逆境響應(yīng)調(diào)控元件，例如ABRE（abscisic acid responsive element）和元件W-box，而且分別存在干旱、鹽和堿等低溫逆境響應(yīng)調(diào)控元件，例如DRE1（dehydration-responsiveelement）等植物環(huán)境脅迫應(yīng)激響應(yīng)調(diào)控元件，同時(shí)也包括能夠參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件，茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件；厭氧感應(yīng)順勢(shì)元件、應(yīng)激響應(yīng)元件。此外，還有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件等細(xì)胞特異性表達(dá)元件。此外，玉米、棉花和擬南芥的SQD基因均存在順式逆境響應(yīng)調(diào)控元件，例如STRE、ABRE、TGACGmotif，說明Zm－SQD3基因響應(yīng)應(yīng)激響應(yīng)、脫落酸等生物逆境信號(hào)。通常認(rèn)為植物激素（水楊酸、脫落酸、茉莉酸甲酯等）在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程和逆境響應(yīng)中具有重要功能[20-21]。

表8 ZmSQD3 基因啟動(dòng)子元件Table 8 Promoter elements of ZmSQD3

2.3 ZmSQD3 基因的表達(dá)模式分析

2.3.1 玉米組織中SQD3基因的表達(dá)譜

為了研究不同發(fā)育階段的玉米的SQD3基因表達(dá)譜，通過玉米eFP 和TAIR 兩種權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)中收集相關(guān)的數(shù)據(jù)信息并進(jìn)行基因表達(dá)分析。如圖9，SQD3基因在玉米營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)各階段的各組織中均有表達(dá)，且觀察到在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的早期葉片和在生殖生長(zhǎng)階段的初期種子中表達(dá)量較高。

圖9 ZmSQD3 基因在不同組織或不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)譜的熱圖Fig.9 Heat map of expression profiles of ZmSQD3 gene in different tissues or different growth stages

2.3.2 環(huán)境脅迫下ZmSQD3基因的表達(dá)分析

為了研究ZmSQD3基因在環(huán)境脅迫中的作用，分析在鹽和低磷脅迫下的表達(dá)模式。通過對(duì)鹽和低磷脅迫下玉米葉片和根系在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與0 d 對(duì)照相比，在兩種環(huán)境脅迫下的1、3 和7 d 中，葉片與根系中的ZmSQD3基因均有響應(yīng)。鹽脅迫下，無論是1、3 d 還是7 d 時(shí)間點(diǎn)根中的ZmSQD3基因都下調(diào)表達(dá)，而葉中的都上調(diào)表達(dá)，3 d時(shí)根中表達(dá)量最高，7 d 時(shí)葉中表達(dá)量最高（圖10A）。低磷脅迫下，無論是在根中還是葉片中均呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但在根中1 d 的表達(dá)量低，在7 d的根中下調(diào)表達(dá)（圖10B）。

圖10 ZmSQD3 基因在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of ZmSQD3 gene under different environment stress

3 討論

研究以玉米自交系合344 為供試材料，克隆ZmSQD3基因，測(cè)序結(jié)果表明克隆的SQD3基因序列與玉米基因組中的相應(yīng)序列一致。生物信息學(xué)技術(shù)可以通過對(duì)基因序列所含的遺傳信息分析，研究被基因控制而形成的蛋白產(chǎn)物，并以此揭示其基因表達(dá)的重要生物學(xué)特征意義[22]。近年來測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很大的發(fā)展，越來越多的物種全基因組已經(jīng)成功完成了測(cè)序工作。研究主要利用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)ZmSQD3基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析、親疏水性、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等分析，SQD3蛋白由437 個(gè)氨基酸組成，不穩(wěn)定系數(shù)為40.33（>40），半衰期為30 h，半衰期與穩(wěn)定性之間也存在著一定的聯(lián)系，通常來講半衰期長(zhǎng)的蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定，所以該基因編碼的蛋白是一種不穩(wěn)定型蛋白[23]。平均疏水系數(shù)為-0.117，表明Zm－SQD3蛋白具有一定的水溶性。

蛋白質(zhì)的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)模型是其多肽鏈本身的折疊，是在一維結(jié)構(gòu)上可以利用氫鍵排列組合起來的結(jié)構(gòu)。但是到目前為止，由于很難對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行精確生物化學(xué)預(yù)測(cè)分析，為了逐步加深對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)空間結(jié)構(gòu)的科學(xué)理解，使用理論計(jì)算法和生物信息學(xué)法來進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。一般只有認(rèn)為當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)二級(jí)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果精確率能夠達(dá)到80%，才可以準(zhǔn)確地進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)組成分子的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)[24]。經(jīng)過分析，Zm－SQD3基因編碼產(chǎn)物由46.00%的α 螺旋、14.19%的不規(guī)則卷曲、6.18%的β 折疊和33.64%的β 轉(zhuǎn)角組成，預(yù)測(cè)可信度超過80%，所以推斷通過此分析方法可以準(zhǔn)確分析該基因編碼序列，繼而進(jìn)行了ZmSQD3蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

通過對(duì)物種間SQD3蛋白的氨基酸序列同源性分析，玉米與高粱的SQD3基因同源性最高為92.62%，與其他幾個(gè)物種的同源性也比較高，表明不同物種間SQD3蛋白質(zhì)非常相似，這與王楓的報(bào)道結(jié)果相同[7]。

通過對(duì)ZmSQD基因啟動(dòng)子上游5 000 bp 進(jìn)行啟動(dòng)子上游基因研究分析，發(fā)現(xiàn)ZmSQD基因啟動(dòng)子含有多個(gè)與玉米植物逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括響應(yīng)環(huán)境脅迫表達(dá)作用抑制元件、與分生組織表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞特異性表達(dá)元件等，此外，Zm－SQD3基因的表達(dá)可能受到水楊酸、脫落酸、茉莉酸甲酯等激素的調(diào)節(jié)。這些基因研究分析結(jié)果表明，SQD3基因可能正是通過這些響應(yīng)環(huán)境脅迫的順式作用元件參與玉米對(duì)脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的應(yīng)答，在植物響應(yīng)脅迫過程中發(fā)揮作用[25]。

基因表達(dá)模式通常是其具有生物學(xué)功能的一種具體表現(xiàn)形式之一[26]。研究通過qrt-pcr 表達(dá)譜熱圖分析，SQD3基因在玉米各組織中均有所表達(dá)，并且在早期葉片發(fā)育階段觀察到B 型的SQD3基因的表達(dá)，這表明它在葉綠體和光合作用中發(fā)揮功能，與前人證明一致[7]。在低磷脅迫下根和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，ZmSQD3基因在低磷處理下均有顯著表達(dá)，且在不同時(shí)期的根和葉片中表達(dá)不同，推測(cè)這可能是因?yàn)榈土姿猁}存在的情況下B 型SQD基因發(fā)揮功能[27]。已有前人研究證明，植物光合作用、滲透調(diào)節(jié)、鹽分脅迫和干旱脅迫等都有SQD基因的參與，尤其在磷酸鹽脅迫條件下，AtSQD2被認(rèn)為與植物對(duì)磷酸鹽脅迫的反應(yīng)直接相關(guān)[23，28]。在磷酸鹽高度脅迫的生長(zhǎng)條件下，擬南芥植物的一個(gè)sqd1或多個(gè)sqd2基因突變體表現(xiàn)出生長(zhǎng)擴(kuò)張性，盡管僅在一個(gè)sqd2突變體中基因檢測(cè)可看到明顯的生長(zhǎng)缺陷和功能缺乏新型陰離子糖酯葡糖苷酸二?；视停℅lcADG）[29-31]。

4 結(jié)論

（1）ZmSQD3與低磷脅迫和非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)，ZmSQD3在低磷脅迫下的玉米幼苗葉片和根系中均顯著表達(dá)。在磷酸鹽饑餓下的玉米葉片和根部組織中，B 型的ZmSQD表達(dá)顯著，在植物抵御磷脅迫中起重要作用。

（2）在植物中，SQDG脂類不僅響應(yīng)干旱脅迫、ABA 誘導(dǎo)、激素等，也響應(yīng)磷脅迫。通過SQD基因的克隆和信息分析得出SQDG脂類在低磷脅迫下起到抗逆的作用，為植物抗逆基因工程育種研究提供幫助。