譚曉君，楊心怡，張雪楊，劉 薇，劉 昆，羅楚萱，劉小柳，吳都督，陳 稚

（1.廣東醫(yī)科大學藥學院，廣東 東莞 523808；2.深圳羅湖人民醫(yī)院醫(yī)學實驗室，廣東 深圳 518002）

阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）是一種起病隱匿的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率逐年上升。國際阿爾茨海默病協(xié)會（ADI）在2021 年阿爾茲海默癥的報告中指出，全球有超過5500 萬人患有失智癥[1]，該病已成為現(xiàn)代社會健康難題。褪黑素是目前臨床上防治AD 常見的抗氧化劑，但其不能從根本上治療AD，并且具有不可忽視的副作用[2]。因此，研究開發(fā)新的防治AD 的抗氧化劑尤為重要。許多中藥或中藥提取物都具有抗氧化的作用，并展示出其作為抗氧化劑對于治療AD 的巨大潛力[3]。中藥提取物成分具有較高的活性以及較少的副作用等優(yōu)勢，能從多個途徑來抑制氧化應激導致的神經(jīng)元凋亡[4，5]。黃芪主要有效成分可通過多種途徑來保護氧化損傷的PC12 細胞[6]，紅景天苷不僅可以清除自由基，保護氧化損傷的神經(jīng)細胞[7]，地黃飲子可以減少線粒體損傷導致的氧化應激，減少脂質(zhì)過氧化，抵抗過度的自由基帶來的損傷[8]。生脈散（Shengmai-san，SMS）是有800 余年歷史的經(jīng)方，源自于《醫(yī)學啟源》卷下：“補肺中元氣不足”，其組成有人參、麥冬、五味子等。三藥合用，具有益氣養(yǎng)陰、保肺生脈的功效，是補肺養(yǎng)心的經(jīng)典方[9]。《醫(yī)方論·卷三·清暑之劑》所云：“肺主氣，心主血，生脈散養(yǎng)心肺之陰，使氣血得以榮養(yǎng)一身”?，F(xiàn)代藥理研究表明[10]，SMS 能改善神經(jīng)系統(tǒng)，并具有抗氧化的作用。近年來，許多研究者探討了關于SMS 抗氧化和改善老年癡呆的作用。由于PC12 細胞常被用于構建氧化應激損傷的細胞模型[11，12]。因此，本實驗擬以PC12 細胞為模型，觀察SMS 對PC12 細胞增殖的影響，檢測氧化損傷前后PC12 細胞各指標量的變化，并探討SMS 保護PC12細胞氧化應激損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人參、麥冬、五味子（廣東時珍制藥有限公司）；神經(jīng)細胞株PC12 細胞（上海細胞庫）；L-DMEM、H-DMEM 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，Solarbio 公司）；胎牛血清（FBS，美國GIBCO 公司）；含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液（吉諾生物公司）；H2O2溶液（分析純，Sigma）；CCK8試劑盒（日本同仁化學研究所）；二甲基亞砜（DMSO，Solarbio 公司）；細胞裂解液（RIPA，Solarbio公司）；PMSF 蛋白酶抑制劑（貝博生物公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific 公司）；6×SDS-PAGE 蛋白上樣定量試劑盒（江蘇碧云天生物研究公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒（均來自南京建成生物工程研究所）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國Milipore 公司）；一抗（兔抗鼠IgG，CST 公司）；二抗（熒光標記的山羊抗兔IgG，CST 公司）；脫脂奶粉（BD 公司）。電子分析天平（美國Sartorius 公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司/5840R 型）；常溫及低速離心機（德國Eppendorf 公司）；渦旋混勻儀（北京六一儀器廠）；恒溫水浴鍋（金壇市杰爾瑞電器有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Scientific 公司）；細胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；BiovTek synergy 多功能酶標儀（BiovTek 公司）；WB 紅外顯影儀（美國Gene Company Linited 公司）；DYCP-24DN 電泳儀（北京六一儀器廠）；垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 SMS 的制備 按生脈散配方比例即人參15.6 g、麥冬9.4 g、五味子4.7 g，稱取定量藥材于5 倍量的75%乙醇中，浸泡120 min 后加熱回流2 h，收集濾液。往濾渣中加入5 倍量的75%乙醇，加熱回流2 h后收集濾液。將收集的2 次濾液混合，過濾并濃縮，獲得濃度為10 g/ml 的SMS 母液。

1.2.2 SMS 對PC12 細胞增殖的影響 通過CCK8 法檢測SMS 對PC12 細胞存活率的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的PC12 細胞消化并離心處理，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，按每孔5000 個細胞加入96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。用DMEM 溶解稀釋SMS，配制成0.1、1.0、5.0 g/ml的低、中、高劑量組，每組濃度設置3 個復孔，在上述條件下培養(yǎng)?？瞻讓φ战M用DMEM 做相同處理。培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 試劑，搖勻，在37 ℃條件下孵育1 h。用酶標儀在450 nm 處測OD 值。取3 個孔的均數(shù)，細胞活力（%）=（實驗孔均值/對照孔均值）×100%。

1.2.3 CCK8 檢測 SMS 對PC12 細胞氧化損傷的保護作用將處于對數(shù)生長期的PC12 細胞按每孔5000個加入96 孔板，每孔體積為100 μl，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗分為5 組：空白對照組、H2O2損傷模型組（200 μmol/L H2O2）、SMS 低劑量組：SMS（0.1 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）、SMS 中劑量組：SMS（1.0 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）、SMS 高劑量組：SMS（5.0 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）。反應24 h 后，加入10 μl CCK8 試劑，37 ℃條件下反應1 h 后，用酶標儀在450 nm 處測OD 值。細胞活力（%）=（試驗孔均值/對照孔均值）×100%。

1.2.4 檢測PC12 細胞上清液中LDH、MDA 含量和SOD 活力 在構建H2O2損傷模型過程中，PC12 細胞內(nèi)的LDH 釋放到胞外，由于活細胞無法釋放LDH，因此通過檢測細胞外LDH 的含量從而反映PC12 細胞的損傷程度。收集1.2.3 處理后的細胞培養(yǎng)液，分別參照3 個測試盒說明書進行操作，隨后用酶標儀在對應波長即在450、530、450 nm 處測定OD 值并根據(jù)相應公式計算LDH、MDA 含量及SOD活力。

1.2.5 SMS 對PC12 細胞的核因子E2 相關因子2（Nrf-2）蛋白表達水平的影響 將PC12 細胞按密度為3×106個/ml 接種于6 孔板，分別設置空白對照組、H2O2損傷模型組、SMS+H2O2組、SMS 組。孵育24 h 后棄上清，PBS 洗2 次后用吸水紙吸干，放置于冰上。每孔加80 μl 蛋白裂解液，并放置在冰上裂解30 min。將細胞碎片與裂解液用細胞刮刮至一側(cè)，并轉(zhuǎn)至1.5 ml EP 管（1.2×104r/min、4 ℃）離心10 min。取其中2.5 μl 上清液用BCA 法測定其蛋白濃度，剩下液體轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中-80 ℃下保存?zhèn)溆?。?0 μg 蛋白，使用10%SDS 聚丙烯凝膠電泳進行分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，并用脫脂奶粉進行封閉，加入相應的一抗，4 ℃過夜。PBST 洗膜，加入熒光二抗，室溫反應2 h，用紅外熒光成像系統(tǒng)顯色。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（）表示，進行單因素方差分析和Newman-keuls 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SMS 對PC12 細胞增殖的影響 與空白對照組比較，PC12 細胞存活率隨SMS 作用時間的延長而增高，隨SMS 含量的增多而增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中在同一含量比較下，SMS 各含量組72 h 的細胞存活率均比48 h 的高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 SMS 對PC12 細胞存活率的影響（，%）

表1 SMS 對PC12 細胞存活率的影響（，%）

注：同一時段，與對照組比較，aP＜0.05；同一含量組，與24h 比較，bP＜0.05，cP＜0.05

2.2 SMS 對H2O2誘導損傷后的PC12 細胞存活率的影響 與空白對照組比較，損傷模型組中H2O2對PC12 細胞殺傷性較大，其細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SMS 低、中、高劑量組的細胞存活率比H2O2損傷模型組高，且呈現(xiàn)出含量依賴性，SMS 含量越高，細胞存活率也相應提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 SMS 對H2O2 誘導損傷后的PC12 細胞存活率的影響（，%）

表2 SMS 對H2O2 誘導損傷后的PC12 細胞存活率的影響（，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2 損傷模型組比較，bP＜0.05

2.3 SMS 對H2O2誘導PC12 氧化損傷后細胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影響 與空白對照組比較，H2O2損傷模型組細胞上清液中LDH 活性、MDA 含量增加，SOD 活力減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與H2O2損傷模型組比較，SMS 低、中、高劑量組可降低損傷后的PC12 細胞培養(yǎng)液中LDH 活性和MDA 含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時能有效地改善PC12 細胞培養(yǎng)液中SOD 的活力水平（P＜0.05）；此外，隨SMS 含量的增多。LDH 活性減弱、MDA 含量降低，SOD 活力則提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 SMS 對H2O2 誘導PC12 氧化損傷后細胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影響（）

表3 SMS 對H2O2 誘導PC12 氧化損傷后細胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影響（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2 損傷模型組比較，bP＜0.05

2.4 SMS 對H2O2誘導PC12 細胞內(nèi)MDA 含量及SOD 活力的影響 與空白對照組比較，H2O2損傷模型組的PC12 細胞內(nèi)MDA 含量增大，而SOD 活力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與H2O2損傷模型組比較，SMS 各含量組均可使PC12 細胞內(nèi)MDA含量降低，使SOD 活力增高。而隨著SMS 含量的增大，MDA 含量降低，SOD 活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 SMS 對H2O2 誘導PC12 細胞內(nèi)MDA 含量及SOD 活力的影響（）

表4 SMS 對H2O2 誘導PC12 細胞內(nèi)MDA 含量及SOD 活力的影響（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2 損傷模型組比較，bP＜0.05

2.5 SMS 對PC12 細胞Nrf-2 核蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，SMS 組的Nrf-2 核蛋白表達增強，H2O2損傷模型組Nrf-2 核蛋白表達下降。與H2O2損傷模型組比較，SMS+H2O2組對PC12 細胞核中Nrf-2 蛋白的表達具有上調(diào)作用。SMS 組中Nrf-2 核蛋白也比SMS+H2O2組的表達高，見圖1。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，SMS 對多種疾病均有一定的藥理作用，而SMS 對心肌氧化損傷的保護作用、對阿爾茲海默癥的預防作用以及抗氧化作用是當前的研究熱點[13]。高歌等[14]通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)SMS 中防治心臟氧化損傷的最佳活性成分。王熙林[15]對SMS 進行體外抗氧化能力實驗，發(fā)現(xiàn)SMS 提取液具有抗氧化作用。林善花[16]探究AD 大鼠口服SMS 后血中的移行成分能被辨識并分析。盧盛文等[17]發(fā)現(xiàn)SMS 干預AD 大鼠的藥效物質(zhì)基礎能被中醫(yī)方證代謝組學技術所分析。然而，這些研究基本都只是集中在生脈散的物質(zhì)基礎上，關于生脈散抗氧化和改善AD的具體機制卻并不清楚。因此，本實驗探討了SMS保護PC12 細胞氧化應激損傷的作用機制。

目前，關于阿爾茲海默癥的發(fā)病機制尚未研究透徹，自由基假說中闡述其致病機制與氧化應激有一定的聯(lián)系[18]。有文獻報道[19，20]，阿爾茲海默癥患者免疫力低下，其神經(jīng)元細胞膜產(chǎn)生大量的自由基，損傷生物膜和細胞器，神經(jīng)細胞長期處于氧化應激的狀態(tài)。研究表明[21]，當細胞受損時，其胞外LDH 活性會增強，MDA 可作為脂質(zhì)過氧化程度以及清除自由基能力的指標，SOD 可反映細胞內(nèi)的抗氧化能力。本研究中CCK8 測定結果顯示，與H2O2損傷模型組比較，SMS 各含量組的細胞存活率上升，說明SMS對氧化損傷的PC12 細胞具有保護作用。此外，本研究通過胞外LDH 活性、胞內(nèi)外MDA 含量及SOD 活力的測定，結果顯示為胞外LDH 活性減弱，胞內(nèi)外MDA 含量均減少以及SOD 活力均增強，說明SMS能修復細胞膜的損傷，減少脂質(zhì)過氧化，并增強自由基清除與抗氧化能力，即SMS 可作為抗氧化劑來幫助細胞抵抗由氧化應激導致的損傷。

Nrf-2 是CNC 轉(zhuǎn)錄因子家族中活力最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，誘導Nrf-2 因子的活化在PC12 細胞抵抗氧化應激損傷中起到非常關鍵的作用[22]。本研究結果中，與對照組比較，H2O2損傷模型組的PC12 細胞核中Nrf-2 蛋白的表達下調(diào)，說明模型組中Nrf-2因子受到抑制，其抵抗氧化損傷的自我保護能力大大減弱；而經(jīng)過SMS 的處理之后，胞核內(nèi)Nrf-2 蛋白的表達上調(diào)，說明SMS 能解除模型組中Nrf-2 因子的抑制狀態(tài)，并增強細胞抵抗氧化損傷的能力。此外，與對照組比較，SMS 組中的Nrf-2 因子的表達上調(diào)，說明SMS 能激活細胞內(nèi)更多的Nrf-2 因子，從而增強抗氧化的自我保護能力。

綜上所述，SMS 對H2O2氧化應激損傷的PC12 細胞具有保護作用，其作用機制可能與SMS激活Nrf-2 轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)Nrf-2 蛋白表達有關，說明SMS 可作為抗氧化劑來保護損傷的PC12 細胞，為SMS 治療阿爾茲海默病提供了一些理論和實驗依據(jù)。