黃 闊，李 棟，王 彬，余 君，劉克建，李青常，米 強，孟慶華，范 黎，葉長文*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2.山東中煙工業(yè)有限責任公司，濟南市歷下區(qū)經(jīng)十路11888 號 250014

3.湖北省煙草科學研究院，武漢市硚口區(qū)寶豐路6 號 430030

雪茄煙作為一種特殊的煙草制品，近年來銷量不斷增加，已逐漸成為煙草行業(yè)新的經(jīng)濟增長點和重點發(fā)展領(lǐng)域［1-3］。雪茄煙葉品質(zhì)不僅受品種、栽培、晾制、農(nóng)業(yè)發(fā)酵等關(guān)鍵技術(shù)的影響，而且受工業(yè)發(fā)酵環(huán)節(jié)的影響［4-5］。工業(yè)發(fā)酵能提高雪茄煙葉品質(zhì)、彰顯雪茄風格特色，是改善雪茄煙葉外觀品質(zhì)、物理特性、內(nèi)在成分、吸食品質(zhì)的關(guān)鍵［5］。而在煙葉發(fā)酵過程中，微生物在其中扮演著重要的角色［6-7］。雪茄煙葉的葉面微生物細菌群落組成豐富，發(fā)酵前細菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵進程而變化，細菌群落在發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用［8-9］。因此，探究雪茄煙葉發(fā)酵過程中微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，對于解析微生物在發(fā)酵過程中的作用，篩選功能微生物，優(yōu)化發(fā)酵工藝，提升雪茄煙葉品質(zhì)具有重要意義。目前，國內(nèi)外關(guān)于雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵的研究主要集中在發(fā)酵條件、發(fā)酵工藝和發(fā)酵介質(zhì)等方面。李晶晶等［10］通過探究不同發(fā)酵條件對雪茄煙葉中TSNAs 及其前體物含量變化的影響，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵條件下的雪茄煙葉樣品中TSNAs含量存在極顯著差異，且TSNAs含量隨發(fā)酵濕度增加而下降，生物堿與硝酸鹽含量均隨發(fā)酵濕度的增加而提高。葉惠源等［11］試驗表明，工業(yè)發(fā)酵是雪茄煙葉品質(zhì)提高的重要過程，定向選擇微生物、酶及輔料類的外源添加物等發(fā)酵介質(zhì)，并輔以配套的發(fā)酵工藝，可實現(xiàn)對雪茄煙葉品質(zhì)和風味特征的定向調(diào)控。以上研究僅涉及發(fā)酵對雪茄煙葉品質(zhì)的影響，而有關(guān)發(fā)酵條件的改變或外源發(fā)酵介質(zhì)的添加對雪茄煙葉自身微生物群落，以及對于雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中細菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的研究則鮮見報道。為此，以國產(chǎn)雪茄煙工業(yè)發(fā)酵過程中茄芯煙葉為研究對象，在混配發(fā)酵環(huán)節(jié)的堆積發(fā)酵過程中，研究雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中細菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)變化的規(guī)律，旨在明確微生物在工業(yè)發(fā)酵過程中的作用機理，為篩選優(yōu)勢功能微生物菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇10 種不同類型雪茄煙葉原料（表1）進行工業(yè)發(fā)酵，發(fā)酵形式為堆積發(fā)酵。具體發(fā)酵步驟：首先，按照產(chǎn)品配方比例及數(shù)量要求，將所需10 種雪茄煙葉原料進行混配摻兌均勻。然后，按照茄芯加料配方配置料液并均勻添加，使加料后茄芯煙葉含水率控制在30%±2%范圍內(nèi)。再將加料后的茄芯煙葉置于發(fā)酵房（溫度45 ℃±2 ℃，相對濕度83%±2%）中進行堆積發(fā)酵，發(fā)酵時間3 d，發(fā)酵過程中每天早晚各通風換氣30 min，翻堆1次。

表1 雪茄煙葉的基本信息Tab.1 Basic information of cigar tobacco

分別在茄芯混配發(fā)酵前（HPFJQ）、混配發(fā)酵中（HPFJZ）和混配發(fā)酵后（HPFJH）3 個階段，采集雪茄煙葉樣品，每個環(huán)節(jié)3個樣品，樣品編號及取樣時間見表2。使用無菌采樣袋，對3 個階段煙葉樣品無菌取樣，每個階段的煙葉各隨機選取250 g，迅速帶回實驗室于-18 ℃冰箱中低溫冷凍保存。

表2 雪茄煙葉樣品信息Tab.2 Information of cigar tobacco samples

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增與測序

于生物安全柜中使用無菌剪刀將葉片剪成約1 cm×1 cm 的小塊，充分混合均勻后，3 個階段樣品各稱取0.5 g，使用FastDNATMSPIN 試劑盒（美國MP Biomedicals 公司）提取總DNA。使用ThermoFisher Scientific（美國Multiskan GO 公司）酶標儀測量基因組DNA濃度和純度。

上游引物為515F（5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'），下游引物為806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）。PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，包括5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μ L，牛血清蛋白（BSA）0.2 μL，20 ng/μL 模板DNA 1 μ L，ddH2O 補足至20μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。使用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR 產(chǎn)物。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對原始數(shù)據(jù)進行拼接和過濾，以獲得有效數(shù)據(jù)并確保結(jié)果的準確性和可靠性。使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）v1.7.0（Caporaso 2010）對原始Illumina fastq 文件進行數(shù)據(jù)讀取、質(zhì)量過濾和比對分析。對操作分類單位（OTU）選擇具有97%成對同一性的閾值。

用t檢驗（P<0.05）分析樣本中的差異物種，找到顯著的微生物群（平均相對豐度>1%）。對于線性判別分析（LDA）效應(yīng)大?。↙EfSe），采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗（α=0.05）來識別類別之間具有顯著差異豐度的分類群，然后使用LDA值估計每個差異豐富特征的效應(yīng)大小（對數(shù)LDA 得分>2.0）。采用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理，用Origin 9.0 制圖，測序數(shù)據(jù)在上海美吉生物醫(yī)藥科技公司I-Sanger 生物信息分析云平臺（https：//cloud.majorbio.com/）進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中細菌群落α多樣性分析

基于OTU水平的發(fā)酵過程中細菌群落α多樣性指數(shù)如圖1 所示。隨著發(fā)酵時間的推進，Sobs 指數(shù)和Chao 指數(shù)先降低后增高，表明與混配發(fā)酵前相比，混配發(fā)酵完成后的細菌群落物種豐富度低于發(fā)酵前水平。Shannon 指數(shù)先降低，后增高；Simpson指數(shù)先增高后降低，表明與混配發(fā)酵前相比，混配發(fā)酵完成后的細菌群落多樣性高于發(fā)酵前水平。測序樣本的Coverage 指數(shù)均在97%以上，說明測序結(jié)果可較好反映所測樣本中細菌微生物情況。

圖1 發(fā)酵過程中細菌群落多樣性的變化Fig.1 Variation in bacterial community diversity during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中細菌群落OTU聚類分析

在97%的相似度水平條件下，對各樣品中所測得的OTU 序列進行聚類分析，3 個樣品中共鑒定出5 個門，6 個綱，19 個目，35 個科，64 個屬，96 個種，118 個OTUs。各樣品中細菌群落分布見表3。隨著發(fā)酵時間的推進，OTU 數(shù)量呈減少趨勢，物種數(shù)量呈先減少，后增多趨勢，發(fā)酵前期群落變化更劇烈。

表3 不同分類水平的細菌群落數(shù)量Tab.3 Number of bacterial communities at different classification levels （個）

圖2 為各樣品在OTU 水平上的Venn 圖。混配發(fā)酵前期的OTU 數(shù)量最多，3 個階段共有的OTUs占30 種，混配發(fā)酵前與混配發(fā)酵中共有的OTUs 占47 種，混配發(fā)酵前與混配發(fā)酵后共有的OTUs 占51種，混配發(fā)酵中與混配發(fā)酵后共有的OTUs占37種。

圖2 雪茄煙葉發(fā)酵過程中細菌群落Venn圖Fig.2 Venn diagram of bacterial communities during cigar tobacco fermentation

2.3 發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

在門水平上，共檢出5 個門類的細菌（圖3），厚壁菌門（Firmicutes）在混配發(fā)酵前、混配發(fā)酵中和混配發(fā)酵后樣本中的平均相對豐度分別為62.29%、72.81%和49.14%。在混配發(fā)酵前占比最高，隨著發(fā)酵時間的推進，平均相對豐度先增加后減少。變形菌門（Proteobacteria）在混配發(fā)酵前、混配發(fā)酵中和混配發(fā)酵后樣本中的平均相對豐度分別為30.31%、17.80%和49.14%。在混配發(fā)酵后占比最高，隨著發(fā)酵時間的推進，平均相對豐度先減少后增加。放線菌門（Actinobacteriota）在混配發(fā)酵前、混配發(fā)酵中和混配發(fā)酵后樣本中的平均相對豐度分別為7.00%、9.26%和9.85%，混配發(fā)酵后占比最高。擬桿菌門（Bacteroidota）在混配發(fā)酵前、混配發(fā)酵中和混配發(fā)酵后樣本中的平均相對豐度分別為0.41%、0.09%和14.27%，混配發(fā)酵后其比例明顯提升，表明發(fā)酵完成后占比明顯增多。疣微菌門（Verrucomicrobiota）在各樣品中占比極低，平均相對豐度均低于0.01%。

圖3 雪茄煙葉發(fā)酵過程中門水平細菌群落平均相對豐度Fig.3 Average relative abundances of bacterial communities at phylum level during cigar tobacco fermentation

在屬水平上，各樣本中細菌群落的基本組成如圖4所示?；炫浒l(fā)酵過程中在屬水平上物種種類從47 種減少到39 種，最終在平均相對豐度大于1%的類群中，隨著發(fā)酵時間的推進，數(shù)量從24 種減少到17種，最終增加到20種。表明發(fā)酵完成后各細菌類群的平均相對豐度之間差異減小，群落多樣性提高。

圖4 雪茄煙葉發(fā)酵過程中屬水平的細菌群落平均相對豐度Fig.4 Average relative abundances of bacterial communities at genus level during cigar tobacco fermentation

在屬水平上，平均相對豐度大于1%的菌群在各樣本間的物種聚類分析結(jié)果如圖5 所示?；炫浒l(fā)酵前，海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）（31.93%）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）（10.34%）、芽胞桿菌屬（Bacillus）（7.27%）為優(yōu)勢菌屬；混配發(fā)酵中，海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）（40.02%）、Terribacillus（13.23%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（9.62%）為優(yōu)勢菌屬；混配發(fā)酵后，叢毛單胞菌屬（Comamonas）（12.01%）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）（14.23%）、Georgenia（9.67%）、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）（8.72%）為優(yōu)勢菌屬。聚類分析結(jié)果表明，混配發(fā)酵前與混配發(fā)酵中各樣本間物種組成有交叉，且聚為一類，但混配發(fā)酵完成后物種組成發(fā)生明顯改變，優(yōu)勢菌屬變化較大，各樣本間重復性較好。

圖5 雪茄煙葉發(fā)酵過程中屬水平細菌群落熱圖Fig.5 Heatmap for bacterial communities at genus level during cigar tobacco fermentation

2.4 發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

在屬水平上，將平均相對豐度大于1%的菌群進行多組比較分析，圖6 僅列出混配發(fā)酵過程中具有顯著性差異的菌群，共有17種菌屬差異顯著。隨著發(fā)酵過程的進行，有10種菌屬平均相對豐度顯著增加，分別是鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、Georgenia、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）、細粒類極小單胞菌屬（Parapusillimonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、DSSF69、溶桿菌屬（Lysobacter）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）、極小單胞菌屬（Pusillimonas）；有7 種菌屬顯著降低，分別是Terribacillus、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Atopococcus、棒桿菌屬（Corynebacterium）、unclassified_f_Carnobacteriaceae、Aerococcus和Atopostipes。

圖6 屬水平樣本的組間差異顯著性分析Fig.6 Difference significance test between samples at genus level

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵完成時物種豐富度低于發(fā)酵前水平，物種多樣性高于發(fā)酵前水平，OTU 數(shù)量隨混配發(fā)酵時間的延長而降低，且發(fā)酵前期變化更為劇烈。這與張鴿等［9］的研究結(jié)果基本一致。相關(guān)研究也表明，發(fā)酵是雪茄煙葉調(diào)制后獨特的加工環(huán)節(jié)，微生物菌群結(jié)構(gòu)變化較為劇烈［12］，發(fā)酵前煙葉帶菌量一般較高，細菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，但隨發(fā)酵進程的推進，煙葉帶菌量不斷減少，發(fā)酵完成時煙葉帶菌量顯著降低［8，13］。

雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中細菌微生物群落的演替規(guī)律表明，優(yōu)勢菌門由發(fā)酵前期的厚壁菌門（Firmicutes）轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)酵后期的變形菌門（Proteobacteria）?；炫浒l(fā)酵前期，海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、芽胞桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢菌屬；混配發(fā)酵中期，海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、Terribacillus、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）為優(yōu)勢菌屬；混配發(fā)酵后期，叢毛單胞菌屬（Comamonas）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、Georgenia、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）為優(yōu)勢菌屬。本研究中也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后細菌的優(yōu)勢菌屬發(fā)生較大變化，發(fā)酵完成后各細菌類群的平均相對豐度之間差異減小，群落多樣性提高，且優(yōu)勢菌屬逐漸發(fā)生轉(zhuǎn)變。由于雪茄煙葉原料來源的差異性等原因，葉面細菌優(yōu)勢菌群可能存在差異，但相關(guān)研究也表明雪茄煙葉發(fā)酵有助于提高群落多樣性［4，12，14］，且優(yōu)勢菌屬逐漸向更有潛在應(yīng)用價值的功能性微生物發(fā)生轉(zhuǎn)變［10，15-16］。

隨著混配發(fā)酵過程的推進，有17 種菌屬變化顯著。其中，10 種菌群平均相對豐度顯著增加：鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、Georgenia、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）、細粒類極小單胞菌屬（Parapusillimonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、DSSF69、溶桿菌屬（Lysobacter）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）和極小單胞菌屬（Pusillimonas）；7 種菌群平均相對豐度顯著降低：Terribacillus、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Atopococcus、棒桿菌屬（Corynebacterium）、unclassified_f_Carnobacteriaceae、Aerococcus和Atopostipes。表明雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中，細菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。對發(fā)酵過程中顯著變化的菌群和優(yōu)勢菌屬比較發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、Georgenia和類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）作為混配發(fā)酵完成后的優(yōu)勢菌屬，平均相對豐度顯著增加，說明在雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中可能發(fā)揮著重要的功能作用，而其與雪茄煙葉品質(zhì)的關(guān)系，以及作為功能微生物進行外源添加的可行性尚有待進一步研究。

4 結(jié)論

雪茄煙葉工業(yè)發(fā)酵過程中細菌群落的物種豐富度降低，多樣性提高，OTU 數(shù)量持續(xù)降低。優(yōu)勢菌門由發(fā)酵前期的厚壁菌門向發(fā)酵后期的變形菌門轉(zhuǎn)變；優(yōu)勢菌屬由海洋芽胞桿菌屬、叢毛單胞菌屬、芽胞桿菌屬向叢毛單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、Georgenia、類芽胞桿菌屬轉(zhuǎn)變。鞘氨醇桿菌屬、Georgenia和類芽胞桿菌屬為混配發(fā)酵完成后平均相對豐度顯著增加的優(yōu)勢菌群，可能在雪茄煙葉發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的功能作用。