謝 飛，陳滿堂，王 昇，謝復(fù)煒，余晶晶，劉瑞紅，王曉瑜，劉紹鋒，劉惠民

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）具有分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制等優(yōu)勢，且分析過程前處理簡單，可以避免衍生化等繁雜的預(yù)處理，在煙草中糖類［1］、氨基酸［2-5］、有機(jī)酸［1］、Amadori 化合物［5-6］和多酚［7-8］等化合物的定性和定量分析方面得到了廣泛應(yīng)用。然而，現(xiàn)有LC-MS技術(shù)對未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定仍面臨挑戰(zhàn)，這是由于在離子化過程中，有些物質(zhì)可與流動相中的離子產(chǎn)生高豐度的加合離子，而準(zhǔn)分子離子［M-H］-和［M+H］+的豐度較低，導(dǎo)致對未知化合物的識別具有不可避免的模糊性。

長期以來，復(fù)雜的加合離子形式被認(rèn)為是LC-MS 分析過程中的一個缺陷，為盡量避免其影響，研究者們采取了不同的策略：①采用負(fù)離子模式對可能在正離子模式下產(chǎn)生競爭性加合離子的分析物進(jìn)行定性和定量。Muzaffar 等［9］采用負(fù)離子電噴霧電離模式對大鼠血漿樣品中阿普斯特進(jìn)行定量分析，以避免離子化過程中競爭性地產(chǎn)生加合離子。②在流動相中加入不易與分析物形成加合離子的鹽。Hirabayashi等［10］通過在流動相中加入碳酸銨來定量洋地黃類強(qiáng)心苷類藥物地高辛，減少分析物與有機(jī)酸（如乙酸鹽、甲酸鹽和三氟乙酸鹽）的加合離子。需要注意的是，有研究表明，不同的加合形式也具有一定的優(yōu)勢，如輔助化合物的定性定量分析［11-13］。Hadavi等［14］將加合離子的形成作為分離巰基尿酸同分異構(gòu)體和立體異構(gòu)體的策略，結(jié)果表明，加合離子的形成促進(jìn)同分異構(gòu)體與立體異構(gòu)體產(chǎn)生不同的分子構(gòu)象，有利于異構(gòu)體的分離鑒定。此外，Ducati等［15］采用碰撞誘導(dǎo)解離法（CID）和電子誘導(dǎo)解離法（EID）對藥物和內(nèi)源性代謝物進(jìn)行LC-MS 分析，結(jié)果表明，多數(shù)分析物的堿金屬離子加合物EID 譜圖中出現(xiàn)了自由基陽離子M+及電子型碰撞碎片，因此提出了采用NIST-EI 譜庫輔助LC-MS 鑒定代謝物的可能性?？紤]到加合離子的兩面性，系統(tǒng)研究加合離子的形成對LC-MS 定性定量分析至關(guān)重要。多酚類化合物對煙草色澤、品質(zhì)和煙氣的生理強(qiáng)度具有重要影響，是衡量煙草質(zhì)量的重要指標(biāo)［16-17］，而對多酚加合離子的系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，本研究中基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)系統(tǒng)研究了綠原酸、莨菪亭和蕓香苷3種多酚在正/負(fù)離子電噴霧電離模式下形成的加合離子，探討不同流動相組成對加合離子形式、豐度和強(qiáng)度的影響，以期為基于LC-MS 的煙草多酚定性定量分析提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

綠原酸、莨菪亭、蕓香苷（>98%），甲醇（>99.9%）（德國Merck 公司）；乙腈（>99.9%，美國J T Baker 公司）；甲酸（>98%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙酸銨（>98%，美國ROE公司）。

1290 Infinity II分析液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB SCIEX TripleTOFTM4600 飛行時間質(zhì)譜儀，Analyst 1.6 工作站，SCIEX OS-Q 定性定量軟件（美國AB SCIEX 公司）；Atlantis@T3 色譜柱（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；CPA225D 型電子天平（感量0.000 01 g，德國Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確稱取各多酚成分標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（精確至0.01 mg），用50%甲醇溶液溶解，定容至100 mL，配制成1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液。采用50%甲醇溶液將各儲備液稀釋至1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 多酚加合離子分析

取各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按以下方法進(jìn)行UPLCQ-TOF/MS分析。

A.色譜條件

色譜柱：Atlantis@T3柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。選用3種溶液為流動相A，分別是：a.水、b.0.1%甲酸溶液、c.含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸溶液，流動相B 為乙腈；等度洗脫：85%A。

B.質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描方式：正負(fù)離子分別掃描；掃描范圍：m/z100～1 000；去簇電壓（DP）：40 V；噴霧電壓（IS）：5.5 kV；霧化氣壓力（GS1）：0.38 MPa；氣簾氣壓力（CUR）：0.24 MPa；輔助氣壓力（GS2）：0.34 MPa；離子源溫度：500 ℃；碰撞能量：10 eV；檢測模式：信息關(guān)聯(lián)采集模式（IDA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚在負(fù)離子模式下的加合離子

2.1.1 加合離子形式及豐度

不同流動相組成對綠原酸、莨菪亭和蕓香苷等3種多酚在負(fù)離子模式下檢出加合離子形式及豐度的影響見圖1。當(dāng)以水為流動相A 時，3 種多酚的質(zhì)譜圖中均未檢出除脫質(zhì)子準(zhǔn)分子離子［M-H］-以外的加合離子。當(dāng)在水相中添加甲酸后，莨菪亭的質(zhì)譜圖中僅出現(xiàn)［M-H］-的峰，綠原酸的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了氯加合離子［M+Cl］-（所占比例為0.71%）、甲酸根加合離子［M+FA-H］-（所占比例為0.33%）和二聚體脫質(zhì)子離子［2M-H］-（所占比例為0.54%）的峰，蕓香苷的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了［M+Cl］-（所占比例為2.25%）和三氟乙酸根（Trifluoroacetate）加合離子［M+TFA-H］-（所占比例為1.32%）的峰。［M+TFA-H］-的形成是因為三氟乙酸在HPLC方法中常作添加劑使用，在LC裝置中可以存在較長時間，而［M+Cl］-的形成，則可能源于質(zhì)譜入口處的鹽沉積［18］。需要注意的是，當(dāng)在水相中添加甲酸后，僅檢出甲酸根（Formate）與綠原酸形成的加合離子，且豐度較低，表明多酚的［M+FA-H］-加合離子不穩(wěn)定，這也是［M-H］-豐度最高的可能原因之一。在水相中繼續(xù)添加乙酸銨后，檢出的莨菪亭和蕓香苷加合離子形式不變，對綠原酸則新增檢出了［M+TFA-H］-（所占比例為0.13%），加合離子的相對豐度無明顯變化。由此可見，在負(fù)離子模式下，不同流動相組成對綠原酸和蕓香苷加合離子的形式有一定程度的影響，對加合離子相對豐度的影響不明顯。此外，3 種多酚的主要離子形式［M-H］-在各流動相條件下，相對豐度均超過96%，對定量的影響有限；但需要注意的是，不同流動相組成下加合離子形式的差異對定性的影響。

圖1 多酚在負(fù)離子模式下檢出的離子形式及豐度Fig.1 Forms and abundances of polyphenol adduct ions in negative mode

2.1.2 加合離子的強(qiáng)度

加合離子的強(qiáng)度是影響分析物定性和定量的重要因素。由圖1可知，多酚在負(fù)離子模式下主要的加合離子形式為準(zhǔn)分子離子［M－H］-。因此，對不同流動相條件下［M-H］-的強(qiáng)度進(jìn)行了討論。不同流動相組成對3種多酚在負(fù)離子模式下［M-H］-峰響應(yīng)強(qiáng)度的影響見圖2，結(jié)果顯示，當(dāng)以水為流動相A時，3種多酚［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度為綠原酸＞莨菪亭＞蕓香苷；當(dāng)水相中加入甲酸后，綠原酸［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度明顯降低（降低42.47%），莨菪亭［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度輕微降低（降低9.35%），蕓香苷［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度明顯升高（升高141.78%）；繼續(xù)向水相中加入乙酸銨后，綠原酸、莨菪亭和蕓香苷［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度均有一定程度的降低，分別降低66.03%、59.91%和74.59%。對比可知，以純水為流動相A時，綠原酸和莨菪亭［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度較高，有利于檢出；以0.1%甲酸溶液為流動相A時，蕓香苷［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度較高，利于檢出?？紤]到不同流動相組成下加合離子形式和響應(yīng)強(qiáng)度的差異對定性和定量仍會產(chǎn)生不同程度的影響，在實際應(yīng)用中應(yīng)保持流動相組成的一致和穩(wěn)定。

圖2 多酚在負(fù)離子模式下［M-H］-的峰強(qiáng)度Fig.2 Intensities of［M-H］- peaks for polyphenols in negative mode

2.2 多酚在正離子模式下的加合離子

2.2.1 加合離子形式及豐度

不同流動相組成對綠原酸、莨菪亭和蕓香苷等3種多酚在正離子模式下檢出加合離子形式及豐度的影響見圖3。在3種流動相體系下，綠原酸和蕓香苷的質(zhì)譜圖中均出現(xiàn)質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子［M+H］+、鈉加合離子［M+Na］+和鉀加合離子［M+K］+峰，莨菪亭的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)［M+H］+和［M+Na］+峰，表明在正離子模式下不同流動相組成對多酚加合離子的形式無明顯影響。鈉加合離子的形成可以用Na+的普遍存在解釋，其可以來源于玻璃器皿、分析樣品，以及分析物和溶劑中的雜質(zhì)［19］。當(dāng)以水為流動相A 時，綠原酸［M+Na］+（所占比例為70.48%）的豐度高于［M+H］+（所占比例為25.96%）和［M+K］+（所占比例為3.57%）；蕓香苷［M+H］+（所占比例為72.45%）的豐度高于［M+Na］+（所占比例為25.73%）和［M+K］+（所占比例為1.81%）；莨菪亭［M+H］+（所占比例為98.42%）的豐度顯著高于［M+Na］+（所占比例為1.58%）。當(dāng)在水相中添加甲酸后，綠原酸和蕓香苷［M+Na］+的相對豐度顯著下降，分別下降至8.81%和7.41%；與此同時，［M+H］+的相對豐度分別上升至90.06%和91.85%。在水相中繼續(xù)添加乙酸銨后，加合離子的相對豐度變化不明顯。由此可見，在正離子模式下，除準(zhǔn)分子離子［M+H］+外，綠原酸和蕓香苷［M+Na］+的相對豐度也較高，這對分析物的定性和定量均具有一定的影響。此外，不同流動相組成對多酚加合離子的相對豐度影響較大，且該影響也與多酚的結(jié)構(gòu)相關(guān)，例如，對綠原酸和蕓香苷影響較大，而對莨菪亭的影響不明顯。

圖3 多酚在正離子模式下檢出的離子形式及豐度Fig.3 Forms and abundances of polyphenol adduct ions in positive mode

2.2.2 加合離子的強(qiáng)度

不同流動相組成對3 種多酚在正離子模式下［M+H］+和［M+Na］+強(qiáng)度的影響見圖4。結(jié)果顯示，當(dāng)以水為流動相A 時，3 種多酚［M+H］+的響應(yīng)強(qiáng)度為莨菪亭＞蕓香苷＞綠原酸；［M+Na］+的響應(yīng)強(qiáng)度為綠原酸≈蕓香苷＞莨菪亭。當(dāng)水相中加入甲酸后，綠原酸和蕓香苷［M+H］+的響應(yīng)強(qiáng)度升高（分別升高297.66%和81.91%），莨菪亭［M+H］+的響應(yīng)強(qiáng)度降低（降低22.93%）；綠原酸、莨菪亭和蕓香苷［M+Na］+的響應(yīng)強(qiáng)度分別降低85.67%、67.22%和58.69%。繼續(xù)向水相中加入乙酸銨后，［M+H］+和［M+Na］+的響應(yīng)強(qiáng)度均有所降低，降低的百分比為41.88%～78.32%。對比可知，以純水為流動相A時，3種多酚［M+Na］+的響應(yīng)強(qiáng)度較高，且此時［M+Na］+的豐度也較高，該流動相條件有利于［M+Na］+的檢出。以0.1%甲酸溶液為流動相A 時，綠原酸和蕓香苷［M+H］+的響應(yīng)強(qiáng)度較高，且此時［M+H］+的豐度也較高，該流動相條件有利于綠原酸和蕓香苷的定性和定量分析?？紤]到在3 種流動相體系下，［M+H］+均為莨菪亭的絕對主要形式（＞98%），［M+Na］+加合離子的形成對莨菪亭定性和定量的影響均可以忽略不計；以純水為流動相A 時，莨菪亭［M+H］+的響應(yīng)強(qiáng)度最高，該流動相條件更利于莨菪亭的定量分析。

圖4 多酚在正離子模式下［M+H］+和［M+Na］+的響應(yīng)強(qiáng)度Fig.4 Intensities of［M+H］+ and［M+Na］+ ionsfor polyphenols in positive mode

2.2.3 不同加合形式的二級質(zhì)譜碎片離子

二級質(zhì)譜中的碎片離子是分析物準(zhǔn)確定性的關(guān)鍵依據(jù)之一。多酚［M+H］+和［M+Na］+的二級質(zhì)譜碎片離子見表1，其中，莨菪亭［M+Na］+豐度較低，未檢出其碎片離子。對綠原酸［M+H］+僅檢出m/z=163.038 3的碎片離子，對［M+Na］+檢出m/z=163.038 5和m/z=215.050 2兩種碎片離子。離子的碎裂機(jī)制如圖5所示。對蕓香苷［M+H］+和［M+Na］+檢出了不同的碎片離子，［M+H］+和［M+Na］+的碎裂機(jī)制如圖6所示。由圖6 可推測［M+Na］+的形成改變了電荷的密度和分布，進(jìn)而產(chǎn)生了不同的碎片離子。對不同加合形式碎裂機(jī)制的解析，有助于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，提高定性的準(zhǔn)確性。

表1 多酚［M+H］+和［M+Na］+的碎片離子Tab.1 Fragment ions of［M+H］+ and［M+Na］+for polyphenols

圖5 綠原酸［M+H］+和［M+Na］+的碎裂機(jī)制Fig.5 Fragmentation pattern of［M+H］+ and［M+Na］+ ions for chlorogenic acid

圖6 蕓香苷［M+H］+和［M+Na］+的碎裂機(jī)制Fig.6 Fragmentation pattern of［M+H］+ and［M+Na］+ ions for rutoside

3 結(jié)論

①負(fù)離子模式下，多酚［M-H］-的相對豐度非常高，其他形式加合離子的相對豐度較低，流動相條件的變化僅對［M-H］-的響應(yīng)強(qiáng)度影響顯著，使用負(fù)離子模式是一種減少多酚加合離子影響的分析策略。②正離子模式下，［M+H］+和［M+Na］+是兩種主要的加合形式，其相對豐度和強(qiáng)度受流動相組成和多酚結(jié)構(gòu)的影響。③同種多酚［M+H］+和［M+Na］+在二級質(zhì)譜中的碎裂機(jī)制不同，能夠提供更豐富的質(zhì)譜信息，對其碎裂機(jī)制的研究能夠提高結(jié)構(gòu)鑒定的準(zhǔn)確性。