胡 珊，彭劍濤，2，莫維弟，周志成，丁海霞，彭麗娟*，2

1.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號(hào) 550025

2.貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號(hào) 550025

3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號(hào) 550025

由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的煙草赤星病主要危害成熟期的烤煙上部葉，發(fā)病嚴(yán)重地塊幾乎絕收，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量［1］。目前化學(xué)防治依然是防治煙草赤星病的主要措施，然而長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和危害人畜健康等問題，且近年來有研究報(bào)道鏈格孢菌對(duì)96%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯醚甲環(huán)唑和97%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氟環(huán)唑［2］及93%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）菌核凈［3］等藥劑已產(chǎn)生抗藥性。而生物防治具有無毒、無殘留和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，成為植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一。

目前，植物病害生物防治中應(yīng)用最廣泛的為芽胞桿菌屬細(xì)菌，因其有抗菌譜廣、耐鹽性強(qiáng)、能產(chǎn)生多種拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性強(qiáng)和生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，具有較高應(yīng)用價(jià)值［4］。宋莉莎等［5］從貴州省甕安縣煙區(qū)土壤中篩選具有拮抗作用的細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）對(duì)鏈格孢菌有較強(qiáng)的抑制作用，其無菌發(fā)酵液對(duì)該病菌抑菌帶可達(dá)23.5 mm。王雯麗等［6］從福建、山東和云南等地?zé)煵萑~片中分離得到187 株菌株，發(fā)現(xiàn)萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽類物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)也有明顯抑制作用，抑制率分別為56.9%和65.0%。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙區(qū)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重，部分地塊發(fā)病率高達(dá)100%，幾乎絕收，給當(dāng)?shù)責(zé)熮r(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為篩選對(duì)該地區(qū)煙草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5點(diǎn)取樣法，從貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重地塊采集健康煙株根際土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行芽胞桿菌分離純化，使用平板對(duì)峙法篩選對(duì)病原真菌具有較好拮抗作用的菌株，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其進(jìn)行鑒定，并通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定該拮抗菌對(duì)煙草赤星病防治效果，旨在為煙草赤星病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試土樣采集于貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重地塊健康烤煙根際，采用5點(diǎn)取樣法取樣后用無菌自封袋封存并編號(hào)。供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）、高粱葉點(diǎn)霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、煙草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），均由貴州大學(xué)煙草學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。供試烤煙品種為K326，選用長(zhǎng)53 mm、寬35 mm、高58 mm 規(guī)格的育苗盆育苗，每盆1 株，待烤煙幼苗生長(zhǎng)至5 片真葉時(shí)，移栽至底徑為140 mm、口徑180 mm、高160 mm 花盆中繼續(xù)生長(zhǎng)至8～ 10片葉備用。

供試藥劑為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（WDG）（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），供試試劑有1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）草酸銨結(jié)晶紫、明膠及9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl溶液等。

1.2 方法

1.2.1 土壤拮抗菌分離

采用稀釋涂布平板法［7］，稱取10 g 土樣放入含90 mL 無菌水的錐形瓶中，置于37 ℃、200 r/min 恒溫?fù)u床振蕩20 min。85 ℃水浴處理10 min 后梯度稀釋得到濃度為10-2、10-3、10-4和10-5的土壤懸浮液。取100 μL稀釋液均勻涂布于LB平板，各濃度3個(gè)重復(fù)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出單菌落后，挑取形態(tài)不同的單菌落純化后編號(hào)，置于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后，與30%（體積分?jǐn)?shù)）甘油等比例混合后置于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌抑菌譜測(cè)定

將5 種植物病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，分別取直徑為6 mm 的菌餅接種到PDA 平板中央（培養(yǎng)皿直徑為85 mm），距中央2.5 cm 處再接種5 μL拮抗菌菌液，以只接種病原菌的PDA平板為對(duì)照，每種病原菌接種4 個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3 次（下同）。待對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，測(cè)量抑菌帶寬度并挑取鏈格孢菌邊緣菌絲，置于Axio Imager M2 蔡司金相顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss Microscopy GmbH 公司）下觀察菌絲形態(tài)。采用十字交叉法［8］測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 拮抗菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將保存的拮抗菌活化后挑取單菌落接種到裝有5 mL LB 培養(yǎng)液的試管中，置于37 ℃、200 r/min 條件下的搖床中培養(yǎng)12 h 后，獲得種子液。使用移液槍吸取1 mL 種子液接種于100 mL 的LB 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，采用比濁法［9］，每隔30 min用分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光度值（OD），直至OD值緩慢下降時(shí)停止測(cè)量。

1.2.4 生物膜測(cè)定

參照Hamon 等［10］測(cè)定生物膜的方法，將活化的芽胞桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.0 時(shí)，4 ℃離心收集菌體，用無菌水洗滌后重懸于等體積的MSgg 培養(yǎng)基中。取5 mL MSgg 培養(yǎng)基加入12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分別滴加10 μL菌懸液，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察成膜情況。

1.2.5 拮抗菌生防相關(guān)酶類測(cè)定

將篩選出具有良好拮抗作用的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、200 r/min 的搖床中過夜培養(yǎng)后，滴加5 μL菌液至蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基和纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基中央，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生消解圈。

1.2.6 拮抗菌鑒定

結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對(duì)篩選的拮抗菌進(jìn)行鑒定。

（1）菌落形態(tài)觀察：將活化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取5 μL 菌液接種于LB 平板中央并置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)特征。

（2）生理生化指標(biāo)：參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［11］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［12］，對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、酶的水解、明膠的液化、檸檬酸鈉鹽的利用、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)及耐鹽試驗(yàn)等多項(xiàng)生理生化特征分析。

（3）16S rDNA、gyrA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析：使用BioTeke 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用細(xì)菌通用引物16S rDNA［13］及gyrA［14］對(duì)提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（北京）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果修正后經(jīng)NCBI 進(jìn)行BLAST 初步比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果下載親緣關(guān)系較近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0軟件上對(duì)各菌株的序列進(jìn)行修正后，以黃熱厭氧芽胞桿菌（Anoxybacillus flavithermus）為外群，使用MEGA 5.0 軟件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹［15］。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株號(hào)及GenBank登錄號(hào)①Tab.1 Strains used in phylogenetic analysis and their corresponding GenBank accession numbers

1.2.7 拮抗菌防治煙草赤星病盆栽試驗(yàn)

待烤煙生長(zhǎng)至8～ 10 片葉時(shí)進(jìn)行處理，采用噴霧法將濃度為1×108cfu/mL 的拮抗菌發(fā)酵液均勻噴施在煙草葉片正面，以液滴不滴落為標(biāo)準(zhǔn)，晾干后在葉片上接種在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d、直徑為6 mm 的鏈格孢菌菌餅，每片煙葉接種4 個(gè)菌餅。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：以噴施無菌水的煙株為CK1；噴施無菌水晾干后接種病原菌的煙株為CK2；噴施發(fā)酵液晾干后接種病原菌的煙株為處理3；噴施2 000 倍液10%苯醚甲環(huán)唑WDG 晾干后接種病原菌的煙株為處理4。每處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 株煙苗。置于光照和黑暗各12 h、溫度為28 ℃、相對(duì)濕度為90%以上的溫室中培養(yǎng)，直至CK2 出現(xiàn)明顯病斑時(shí)，根據(jù)赤星病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［16］進(jìn)行病害調(diào)查（以葉片為單位），并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。

計(jì)算公式：

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，運(yùn)用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan’s 新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選及抑菌譜測(cè)定

從采集的土壤中分離純化后共獲得96 株芽胞桿菌，通過對(duì)峙培養(yǎng)篩選到1 株具有較好拮抗作用的菌株（圖1），編號(hào)為L(zhǎng)249。該菌對(duì)5 種植物病原真菌均具有良好抑制作用，抑制率均在60.00%以上（表2），其中對(duì)鏈格孢菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)72.27%。

圖1 菌株L249對(duì)4種植物病原真菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of strain L249 against four plant pathogens

表2 菌株L249對(duì)5種病原真菌的抑制作用①Tab.2 Inhibition effects of strain L249 against five target fungal pathogens

培養(yǎng)7 d后，挑取鏈格孢菌菌絲在蔡司顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照菌絲挺直，粗細(xì)均勻，而與L249對(duì)峙培養(yǎng)后，菌絲出現(xiàn)粗細(xì)不均勻、旋轉(zhuǎn)結(jié)節(jié)及腫大等現(xiàn)象（圖2）。

圖2 菌株L249對(duì)鏈格孢菌的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of strain L249 on Alteraria alternata

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

生長(zhǎng)速率測(cè)定結(jié)果表明（圖3），菌株L249 在0～ 2 h 內(nèi)生長(zhǎng)較慢，處于延滯期，2～ 4 h 生長(zhǎng)逐漸加快，4 h后生長(zhǎng)速率劇增，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4～ 6 h生長(zhǎng)速率最快，6～ 14 h 菌株生長(zhǎng)量持續(xù)增加，14 h后OD600值達(dá)到最大。培養(yǎng)16～ 26 h 后菌株生長(zhǎng)量基本保持不變，到達(dá)穩(wěn)定期，26 h 以后開始下降，進(jìn)入衰亡期。

圖3 菌株L249的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain L249

2.3 生物膜和生防相關(guān)酶類檢測(cè)

如圖4 所示，菌株L249 在液氣交界處能形成復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)，可在蛋白酶和纖維素酶平板上產(chǎn)生透明消解圈，表明該菌可產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。

圖4 菌株L249菌落形態(tài)、生物膜、蛋白酶和纖維素酶檢測(cè)Fig.4 Detection of colony morphology,biofilm,protease,and cellulase of strain L249

2.4 拮抗菌L249鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)及生理生化特性

菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)（圖4），菌株L249在LB培養(yǎng)基平板上呈乳白色，菌落表面有褶皺，邊緣不整齊。菌株的生理生化特征如表3 所示，菌株L249 革蘭氏染色為紫色，能產(chǎn)生多種水解酶，明膠液化、甲基紅試驗(yàn)及V-P試驗(yàn)等反應(yīng)均呈陽性，檸檬酸鈉鹽利用、苯丙氨酸脫氫酶和吲哚試驗(yàn)等反應(yīng)均呈陰性且具有較好的耐鹽性。

表3 菌株L249的生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical reactions of strain L249

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于16S rDNA 和gyrA 基因序列構(gòu)建了菌株L249 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果顯示菌株L249 與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilisNRRL B-4219*）聚為一支，且支持率為100%，結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特性及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。菌株L249的16S rDNA和gyrA基因序列已提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)分別為MT786346和MT802123。

圖5 基于16S rDNA和gyrA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on merged sequences of 16S rDNA and gyrA

2.5 盆栽防病試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），L249 發(fā)酵液對(duì)煙草赤星病具有明顯防治效果，經(jīng)其處理后煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照，相對(duì)防效為60.66%，與10%苯醚甲環(huán)唑WDG 的相對(duì)防效無顯著差異。

表4 拮抗菌L249發(fā)酵液對(duì)煙草赤星病的盆栽防治效果①Tab.4 Disease control effect of fermentation broth antagonistic strain L249 on tobacco brown spot disease in pot

3 討論

本研究中從煙草根際分離得到一株具有較好拮抗作用的枯草芽胞桿菌L249，該菌對(duì)鏈格孢菌、高粱葉點(diǎn)霉菌、大斑突臍蠕孢菌、煙草炭疽菌及尖孢鐮孢菌等5 種病原真菌均有一定抑制作用，表現(xiàn)出良好的廣譜抑菌活性，具有潛在的生防利用價(jià)值，這與王欣悅等［17］對(duì)枯草芽胞桿菌抑菌機(jī)制的研究結(jié)果一致。對(duì)峙培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌L249 可以有效抑制鏈格孢菌生長(zhǎng)并造成菌絲生長(zhǎng)稀疏和膨大畸形，這與任建雯［18］研究貝萊斯芽胞桿菌B56 與鏈格孢菌對(duì)峙培養(yǎng)后，菌絲也出現(xiàn)斷裂增多、膨大畸形及生長(zhǎng)速度變慢等現(xiàn)象相似。本研究中還發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌L249 能形成生物膜，可產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶及硝酸還原酶等生防相關(guān)酶類降解病原真菌細(xì)胞壁從而抑制病原菌生長(zhǎng)，這與馬佳等［19］研究解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501 抑菌機(jī)制的結(jié)果相符?？莶菅堪麠U菌L249 生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，該菌延滯期短，4 h 就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h 便達(dá)到最大生物量。菌株發(fā)酵時(shí)間短、生物量大及活力強(qiáng)，可節(jié)約生產(chǎn)成本，為今后工業(yè)化應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

本研究中測(cè)定了煙草赤星病的室內(nèi)盆栽防效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株L249 發(fā)酵液處理煙葉后，可顯著降低煙草赤星病的病情指數(shù)，相對(duì)防效達(dá)60.66%，與羅楚翔等［20］和葉愛萍等［21］研究枯草芽胞桿菌對(duì)煙草赤星病的室內(nèi)防效相比存在一定差異，推測(cè)這可能與供試枯草芽胞桿菌來源不同有關(guān)。除對(duì)煙草赤星病有較好防治效果外，枯草芽胞桿菌對(duì)其他植物病害也有良好防治效果［22-23］。本試驗(yàn)僅用枯草芽胞桿菌L249 對(duì)煙草赤星病進(jìn)行室內(nèi)防效測(cè)定，該菌對(duì)其他植物病害是否也具有較好的防治效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

從貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙區(qū)健康煙草根際土壤中分離到一株對(duì)鏈格孢菌有明顯拮抗作用的菌株L249，經(jīng)鑒定為枯草芽胞桿菌。該菌能有效抑制鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)并造成菌絲膨大畸形，且對(duì)高粱葉點(diǎn)霉菌、大斑突臍蠕孢菌、煙草炭疽菌及尖孢鐮孢菌等4種病原真菌也有一定抑制作用。該菌生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)14 h可達(dá)到最大生長(zhǎng)量。菌株L249能產(chǎn)生形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物膜，能產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶及硝酸還原酶等生防相關(guān)酶類，盆栽試驗(yàn)表明其發(fā)酵液可有效降低煙草赤星病的病情指數(shù)。