施河麗，向必坤，朱宗第，左 梅，彭五星，尹忠春，王 剛，陶德欣，付 裕，陸承念，譚 軍*

1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119 號 445000

2.中國煙草總公司湖北省公司，武漢市硚口區(qū)寶豐路6 號 430030

土壤酸化可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害，不僅會加速土壤養(yǎng)分的流失，使土壤肥力下降［1］，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，同時還會使土壤中鋁、錳和鎘等毒性元素的活性增加，使得農(nóng)作物對有害元素的吸收量增加［2］，此外還會破壞土壤微生態(tài)平衡，使得病原物蔓延，大大加重了青枯病等土傳病害的發(fā)生［3-6］。土壤酸化是一個長期、漸進的過程，在全國范圍內(nèi)普遍發(fā)生，南方地區(qū)尤為嚴重［7］。

受氣候環(huán)境、種植制度和施肥等因素的影響［8］，近年來煙區(qū)植煙土壤酸化問題日趨嚴重。植煙土壤酸化后通過自身作用難以修復(fù)，只能采用輪作、合理配施肥料以及施用生石灰、生物質(zhì)炭等改良劑的方法進行改良。其中，施用生石灰是煙區(qū)改良酸性土壤，防控?zé)煵萸嗫莶。?-10］，提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量和安全性的有效措施［11-12］，目前在煙區(qū)推廣較多，技術(shù)較為成熟。前人的研究已經(jīng)證實，合理施用生石灰可提高土壤pH，增加土壤有效養(yǎng)分含量［13-14］，對改善酸化土壤微生態(tài)環(huán)境具有積極作用。淡俊豪等［15］研究發(fā)現(xiàn)，施用生石灰對酸性土壤微生物群落功能多樣性的提高有較大的促進作用；梁軍偉［16］通過研究初步闡明了生石灰在皖南煙區(qū)酸性土壤中的改良效果，土壤細菌多樣性顯著增加。煙草青枯病是煙區(qū)發(fā)生最普遍、危害最嚴重的土傳病害之一，其發(fā)生與土壤微生物群落之間關(guān)系密切［17］，改善土壤微生態(tài)環(huán)境是防控?zé)煵萸嗫莶〉囊粭l有效途徑［18］。為進一步明確生石灰通過改善酸化土壤微生態(tài)環(huán)境降低煙草青枯病發(fā)生的可能原因，通過高通量測序技術(shù)分析施用生石灰對酸化土壤細菌群落代謝功能的影響以及土壤細菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系，以期為生石灰在煙葉生產(chǎn)中的合理施用以及煙草青枯病的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗點基本情況

試驗于2020—2021年在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮(zhèn)水井坳村進行。試驗地為煙草連作10 年以上，煙草青枯病發(fā)病率達60%以上煙田。田塊地理坐標為東經(jīng)109.38°，北緯29.97°，海拔1 004 m，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤型山地氣候，年平均氣溫13.7 ℃，年平均降水量1 635.3 mm，無霜期263 d。土壤類型為山地黃棕壤，土壤質(zhì)地為壤土，耕層土壤（0～20 cm）基本理化性質(zhì)為：pH 5.19，有機質(zhì)22.6 mg/kg，堿解氮117.9 mg/kg，有效磷104.5 mg/kg 和速效鉀290.5 mg/kg。供試烤煙品種為云煙87，試驗所用生石灰為當?shù)厥惺邸?/p>

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置4個處理，見表1。采用隨機區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)，行株距為1.20 m×0.55 m，每小區(qū)種植烤煙60株。田間管理按當?shù)爻Ｒ?guī)方法進行。

表1 試驗設(shè)計Tab.1 Experimental design（kg·hm-2）

1.3 土壤樣品采集

2021 年煙葉采收結(jié)束后，采用5 點取樣法采集0～20 cm耕層土壤。每個處理3個重復(fù)，共計12個土壤樣品。將采集的每個土壤樣品分成兩部分，分別放入標記好的自封袋中。一部分土樣置于干冰中帶回實驗室，保存于-80 ℃冰箱，用于土壤微生物DNA提?。涣硪徊糠滞翗幼匀伙L(fēng)干、去雜、研磨和過篩，用于測定土壤pH、有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣、交換性鎂、可交換酸度、可交換氫和可交換鋁等指標。

1.4 測定方法

1.4.1 田間病害調(diào)查

參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》［19］調(diào)查煙草青枯病發(fā)生情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。煙苗移栽后每隔30 d 調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查3次。

1.4.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測定

采用電位法測定土壤pH［20］；采用重鉻酸鉀容量法測定有機質(zhì)含量（質(zhì)量分數(shù)）［20］；采用擴散法測定堿解氮含量［21］；采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量［21］；采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定速效鉀含量［21］；采用乙酸銨交換-原子吸收分光光度法測定交換性鈣和交換性鎂含量［21］；采用氯化鉀提取-滴定法測定土壤可交換酸度、可交換氫和可交換鋁含量［22］。

1.4.3 土壤微生物測序分析

提取土壤樣品總DNA，以樣品DNA 為模板，采用引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′），806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）對細菌16S rDNA V3-V4 區(qū)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測合格后，利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（美國Illumina 公司）進行文庫構(gòu)建，使用NovaSeq6000（美國Illumina 公司）測序平臺進行測序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以97%的一致性將有效序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units，操作分類單元）。利用Mothur 方法與SILVA 138 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫對OTUs 序列進行物種注釋分析。利用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計算Sobs（Observed species）、Shannon、Simpson、Chao1 和Ace 等多樣性指數(shù)。利用SPSS 22.0 中的皮爾遜（Pearson）法分析土壤細菌群落多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性。利用典范對應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和Mantel test 分析影響土壤細菌群落的主要環(huán)境因子，在進行典范對應(yīng)分析時，先剔除共線性嚴重的環(huán)境因子后再進行分析。利用Tax4Fun 工具對細菌群落功能進行預(yù)測［23］。部分數(shù)據(jù)整理與分析采用Excel 2010和DPS 15.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用生石灰后煙草青枯病的發(fā)生情況

2020—2021年各處理煙草青枯病的發(fā)生情況見表2。2020年，移栽后30 d，T1處理（對照）的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著高于T2、T3 和T4 處理，且T2、T3和T4 處理對煙草青枯病的防效分別為60.07%、89.93%和89.93%；移栽后60 d，T2、T3 和T4 處理對煙草青枯病的防效分別為21.03%、55.28%和44.72%；移栽后90 d，T2、T3和T4處理對煙草青枯病的防效分別為29.87%、40.27%和28.57%。2021 年，移栽后30 d，T2、T3 和T4 處理對煙草青枯病的防效分別為66.47%、100.00%和100.00%；移栽后60 d，T2、T3 和T4 處理對煙草青枯病的防效分別為28.46%、79.95%和46.70%；移栽后90 d，T2、T3 和T4處理對煙草青枯病的防效分別為26.10%、60.88%和36.97%。通過連續(xù)2 年的田間試驗，說明施用生石灰有降低煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)的趨勢。

表2 不同處理對煙草青枯病的防效①Tab.2 Control effects of different treatments on tobacco bacterial wilt

2.2 施用生石灰后土壤化學(xué)性質(zhì)的變化

由表3 可見，T2 處理的土壤有機質(zhì)含量顯著高于T1 處理，T2 處理的土壤堿解氮含量顯著高于T3處理。通過連續(xù)2年的田間試驗，表明施用生石灰有提高酸化土壤pH、有機質(zhì)、速效鉀、交換性鈣和交換性鎂含量的趨勢。

2.3 土壤細菌群落多樣性分析

由表4 可見，T3 和T4 處理的Sobs 指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace 指數(shù)顯著高于T1 和T2 處理，T2 處理的Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯著高于T1處理，T3 和T4 處理的Shannon 指數(shù)顯著高于T1 處理。以上結(jié)果表明，施用生石灰可提高酸化土壤細菌群落的多樣性。

表4 不同處理土壤細菌群落多樣性指數(shù)Tab.4 Diversity indexes of soil bacterial community under different treatments

2.4 土壤細菌群落多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系

由表5 可見，土壤pH 與Sobs 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；土壤有效磷與Sobs 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)呈顯著負相關(guān)關(guān)系；土壤交換性鈣與Sobs 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說明土壤pH、交換性鈣和有效磷含量可能是影響酸化土壤細菌群落多樣性的重要因子。

表5 土壤細菌群落多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性①Tab.5 Correlations between diversity indexes of soil bacterial community and soil chemical properties

2.5 土壤細菌群落物種組成及差異分析

對相對豐度占比前10 位的土壤細菌門進行了分析（表6），結(jié)果表明，不同處理土壤細菌群落在門水平上的相對豐度存在差異。施用生石灰后，變形菌門和芽單胞菌門等2 個土壤細菌門的相對豐度表現(xiàn)出降低的趨勢，其中T4處理變形菌門和芽單胞菌門的相對豐度顯著低于T1處理。施用生石灰后，放線菌門、綠彎菌門、黏球菌門和硝化螺旋菌門4個土壤細菌門的相對豐度表現(xiàn)出增加的趨勢，其中T3和T4處理放線菌門、綠彎菌門和黏球菌門的相對豐度顯著高于T1處理，T4處理硝化螺旋菌門的相對豐度顯著高于T1 和T2 處理，T3 處理硝化螺旋菌門的相對豐度顯著高于T2 處理。說明適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可提高酸化土壤放線菌門、綠彎菌門和黏球菌門的相對豐度。

相對豐度高于1%的土壤細菌屬共有12 個（表7）。與T1 處理相比，Ellin6067和Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia在T3和T4處理中的相對豐度顯著降低；褚氏桿菌屬在T2處理中的相對豐度顯著高于T4處理；雷爾氏菌屬和Bryobacter在T1和T2處理中的相對豐度顯著高于T3處理。說明適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可降低酸化土壤Ellin6067和Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia的相對豐度。

表7 土壤細菌群落主要屬的相對豐度Tab.7 Relative abundance of major genus of soil bacterial community（%）

2.6 土壤細菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

通過方差膨脹因子剔除共線性嚴重的環(huán)境因子后，有8 個環(huán)境因子入選。由圖1 可見，CCA1 和CCA2 累積解釋變量可達69.45%（CCA1：45.53%，CCA2：23.92%），能夠反映環(huán)境因子對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。CCA1與pH、交換性鈣、交換性鎂和可交換氫具有正相關(guān)關(guān)系，與堿解氮、速效鉀和交換性鋁負相關(guān)。由Mantel Test分析結(jié)果（表8）可知，pH、交換性鈣、交換性鎂和可交換鋁對土壤門水平細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著的影響，可能是影響土壤細菌群落的重要環(huán)境因子。

圖1 土壤門水平細菌群落與環(huán)境因子間的典范對應(yīng)分析Fig.1 Canonical correspondence analysis between soil bacterial community and environmental factors at phylum level

表8 土壤門水平細菌群落與環(huán)境因子之間的Mantel test結(jié)果Tab.8 Mantel test results of relationships between soil bacterial community and environmental factors at phylum level

2.7 土壤細菌群落功能預(yù)測

為探究施用生石灰后土壤細菌的變化情況，通過Tax4Fun 軟件進行細菌功能預(yù)測分析，結(jié)果獲得一級功能分組6類，二級功能分組39類，其中相對豐度大于1.0%的二級功能分組有21 類。由表9 可見，一級功能分組中相對豐度排在前3位的是新陳代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理，其占比分別為47.08%～47.48%、19.97%～20.25%和14.12%～14.55%。與T1處理相比，T4處理新陳代謝這1類一級功能分組的相對豐度顯著增加；T3和T4處理遺傳信息處理這1類一級功能分組的相對豐度顯著增加，而環(huán)境信息處理和人類疾病這2類一級功能分組的相對豐度顯著降低。適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可增加遺傳信息處理這1類一級功能分組的基因豐度，降低環(huán)境信息處理和人類疾病這2類一級功能分組的基因豐度。

表9 土壤細菌群落中一級功能分組的相對豐度Tab.9 Relative abundance of Level 1 functional groups in soil bacterial community（%）

由表10可見，相對豐度大于1.0%的21類二級功能分組中，涉及新陳代謝功能的有12項，涉及遺傳信息處理功能的有4項，涉及環(huán)境信息處理功能的有2項，涉及細胞過程功能的有3 項。相對豐度大于5.0%的二級功能分組包含碳水化合物代謝、氨基酸代謝、翻譯、復(fù)制與修復(fù)和膜運輸這5 類。T1 和T2處理、T1 和T3 處理、T1 和T4 處理分別有0、6 和9 類二級功能分組存在顯著差異；T2和T3處理、T2和T4處理分別有6和7類二級功能分組存在顯著差異；T3和T4處理有1類二級功能分組存在顯著差異。適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可增加能量代謝、萜類和多酮類代謝、翻譯和折疊、分類與降解這4類二級功能分組的基因豐度，降低膜運輸這1類二級功能分組的基因豐度。

表10 土壤細菌群落中相對豐度大于1.0%的二級功能分組Tab.10 Level 2 functional groups with relative abundance greater than 1.0% in soil bacterial community（%）

3 討論

生石灰處理酸化土壤后，可提升酸化土壤pH至煙草生長的適宜范圍（pH 5.5～6.5），還可提高土壤交換性鈣和交換性鎂含量，且土壤交換性鈣含量的提高幅度要遠高于交換性鎂，這可能是由于生石灰的主要成分是氧化鈣，而氧化鎂的含量較少，且該結(jié)果與胡敏等［24］報道的施入生石灰可提高土壤pH，改善土壤酸度，提高土壤交換性鈣和交換性鎂含量的結(jié)果相符。然而，長期大量施用生石灰會加劇土壤復(fù)酸化，導(dǎo)致土壤板結(jié)和鉀、鈣、鎂等營養(yǎng)元素不平衡［25-26］，因此實際應(yīng)用中應(yīng)注意生石灰的用量，合理施用。

適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）處理酸化土壤后，土壤中放線菌門、綠彎菌門和黏球菌門等優(yōu)勢菌群的相對豐度顯著升高。其中，放線菌門作為土壤中主要門之一，能產(chǎn)生種類繁多的抗生素，對植物病害有明顯的防治作用；綠彎菌門通常作用于土壤碳水化合物的水解，還參與了氮和硫等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程［27］。因此，適量生石灰處理可通過提高土壤細菌群落的多樣性和增加有益微生物的豐度顯著改變酸化土壤微生物群落，從而提高酸化土壤的健康質(zhì)量，這與張義杰等［28］施用生石灰調(diào)控三七酸化土壤的研究結(jié)果相符。土壤細菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系分析結(jié)果表明，土壤pH、交換性鈣、交換性鎂和可交換鋁可能是影響酸化土壤細菌群落的主要環(huán)境因子，其中以土壤pH最為重要。施用生石灰可提高酸性土壤pH、交換性鈣和交換性鎂含量，降低可交換鋁含量，從而影響土壤細菌的數(shù)量、分布和組成，促進土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，增加煙株對病原體入侵的抵抗力［29-30］，抑制煙草青枯病的發(fā)生。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)，生石灰處理的煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)均低于對照處理，也證明了可通過對酸化土壤微生態(tài)的改善來減輕煙草青枯病的發(fā)生，從而說明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與煙草青枯病的發(fā)生密切相關(guān)。

適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）處理酸化土壤后，可增加土壤細菌群落能量代謝、萜類和多酮類代謝、翻譯、折疊、分類與降解這4 類功能的基因豐度，降低膜運輸功能的基因豐度，這表明生石灰在使土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的同時，也使土壤細菌代謝功能發(fā)生了相應(yīng)變化。土壤細菌代謝功能活躍對植物生長極為重要，如能量代謝與攝取能量密切相關(guān)；通過萜類和多酮類代謝產(chǎn)生萜類和多酮類次生代謝物，大多數(shù)萜類化合物與植物的抗病性、抗逆性和各種生物相互作用有關(guān)［31］，許多多酮類化合物具有抗細菌、抗真菌、殺蟲等活性［32］，這種代謝水平上的變化可能會抑制土壤中青枯病原菌的傳播；而膜運輸功能的降低，可能減弱了青枯病原菌的移動和侵染根系的速度［33-34］，抑制了煙草青枯病的發(fā)生。

4 結(jié)論

高通量測序分析表明，適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可提高酸化土壤細菌群落多樣性；放線菌門、綠彎菌門和黏球菌門等有益菌群的相對豐度升高；增加能量代謝、萜類和多酮類代謝、翻譯、折疊、分類與降解功能的基因豐度，降低膜運輸功能的基因豐度。通過土壤細菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系分析，確定了影響土壤細菌群落的主要環(huán)境因子是土壤pH、交換性鈣、交換性鎂和可交換鋁，其中土壤pH是影響土壤細菌群落最重要的因子。適量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）在改善酸化植煙土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和代謝功能中具有積極作用，并能有效預(yù)防煙草青枯病的發(fā)生。