曹景林，程君奇，李亞培，吳成林，王 欣

湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢市硚口區(qū)寶豐路6 號 430030

近年來，單倍體育種在作物育種中得到了廣泛的應(yīng)用，其作為現(xiàn)代高效育種體系的重要組成部分，具有縮短育種年限、提高選擇效率等優(yōu)點(diǎn)［1-3］。通常，可以通過體外培養(yǎng)花藥或小孢子產(chǎn)生單倍體，即花藥起源的單倍體，也稱作雄性單倍體。該技術(shù)在白菜、菜花等蔬菜作物育種中廣泛應(yīng)用［4-5］，但茄科類作物如茄子［6］、馬鈴薯［7］的小孢子培養(yǎng)難度大，大多研究仍停留在愈傷組織或類胚狀體階段。而同為茄科作物的煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，早在20 世紀(jì)中后期美國煙草育種工作者在利用花藥或小孢子體外培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體方面取得了很大的進(jìn)展，技術(shù)日臻完善［8］。但研究發(fā)現(xiàn)，花藥起源的單倍體經(jīng)加倍后往往產(chǎn)量和品質(zhì)性狀劣化嚴(yán)重，育種利用的價(jià)值有限，再加上這類單倍體的加倍頻率很低，通常只有1%左右，目前這種方法在煙草育種中已很少使用［9］。

產(chǎn)生煙草單倍體的另一種方法是離體培養(yǎng)子房或胚珠，即卵細(xì)胞起源的單倍體，也稱作雌性單倍體。這種單倍體經(jīng)加倍后倍性和性狀變異小，后代較穩(wěn)定［10］，由于采用子房或胚珠為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，不牽涉及花粉，因此這種技術(shù)適用于雄性不育植物［11］。即使從雄性不育植物的雌性雙單倍體植株得不到種子，也可以利用組培技術(shù)擴(kuò)繁種苗，或直接用于生產(chǎn)，或作為雜交種親本使用。Wernsman等［12］于1979 年開始煙草未授粉子房培養(yǎng)研究，并成功獲得了單倍體植株。將煙草雌性單倍體和雄性單倍體加倍后的雙單倍體與來源親本進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，雌性雙單倍體優(yōu)于雄性雙單倍體，雌性雙單倍體與來源親本更相似，不會(huì)造成產(chǎn)量和品質(zhì)的劣變［13］。若采用雜交種未受精卵細(xì)胞培養(yǎng)，則獲得的雙二倍體品系與常規(guī)自交相似［9,13］。目前，這種技術(shù)已成功應(yīng)用于煙草育種中［9］。祝仲純等［14-16］曾對普通煙草品種Copusyeusuheku No.4、NC2326、革新五號等進(jìn)行了未授粉子房培養(yǎng)，以子房為外植體直接將子房接種于H 培養(yǎng)基（附加生長素IAA 0.5 mg/L 和細(xì)胞分裂素KT 2 mg/L）上培養(yǎng)，僅Copusyeusuheku No.4通過子房培養(yǎng)獲得單倍體植株。吳伯驥等［17］對普通煙草品種柳葉煙、金星煙、黃苗榆和黃花煙草品種甘肅黃花煙進(jìn)行了未授粉子房培養(yǎng)，直接將子房接種于改良的H 培養(yǎng)基（附加生長素IAA 0.5 mg/L 和細(xì)胞分裂素6-BA 2 mg/L）上培養(yǎng)，獲得了單倍體植株。祝仲純等［18］采用N6培養(yǎng)基（附加生長素IAA 0.5 mg/L、細(xì)胞分裂素KT 6 mg/L、肌醇100 mg/L和蔗糖8 g/L）對大葉黃煙未傳粉子房進(jìn)行了培養(yǎng)，獲得了再生植株，但頻率低，僅占4%。雖然提高培養(yǎng)基中生長素用量后能夠誘導(dǎo)出旺盛的愈傷組織，然后分化出大量的幼苗，但產(chǎn)生單倍體植株的頻率低。潘莉等［19］采用附加2,4-D 和6-BA 的H 培養(yǎng)基對普通煙草品種NC89未傳粉子房進(jìn)行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同6-BA濃度對子房生長的影響不同，6-BA濃度為8.89 μmol/L時(shí)，子房能夠直接產(chǎn)生胚狀體進(jìn)而形成小苗。上述研究均以花粉發(fā)育時(shí)期為依據(jù)，對可育純系品種的子房進(jìn)行培養(yǎng)，而有關(guān)雄性不育雜交種未傳粉子房的培養(yǎng)，尤其是通過未受精胚珠培養(yǎng)獲得雄性不育煙草單倍體植株的研究至今鮮見報(bào)道。為此，在前人研究的基礎(chǔ)上，開展了KRK26未受精胚珠培養(yǎng)試驗(yàn)，旨在通過不同培養(yǎng)基類型的篩選，確定最適于培養(yǎng)的子房發(fā)育時(shí)期和外植體形式，為利用煙草胚珠高頻率誘導(dǎo)單倍體植株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以津巴布韋引進(jìn)的雄性不育烤煙雜交種KRK26的未授粉胚珠為材料。為了保證整個(gè)試驗(yàn)期間均能得到胚珠，將煙草分兩期播種和盆栽，間隔30 d，采用的栽煙盆內(nèi)徑為30 cm，每次盆栽100株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 適宜發(fā)育時(shí)期和外植體形式的確定

在煙草開花期，選取5 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（圖1，K1～K5）的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，篩選胚珠離體培養(yǎng)的最佳發(fā)育時(shí)期，并參考文獻(xiàn)［10］的方法，將不同發(fā)育時(shí)期（即K1～K5）的子房制作成厚度為6～8 μm 的石蠟切片，并將切片置于顯微鏡（DM 2500，德國Leica公司）下，觀察并拍照各個(gè)時(shí)期胚囊的發(fā)育情況，從細(xì)胞水平選取最佳發(fā)育時(shí)期。

圖1 5個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚珠對應(yīng)的花蕾狀態(tài)Fig.1 Flower bud states corresponding to ovules at five development stages

將采集的5個(gè)時(shí)期的花蕾放入1 g/L的升汞溶液中消毒7～9 min，然后用無菌水沖洗3～4次，隨之在無菌條件下將消毒后的花蕾基部切掉，分別用鑷子擠出子房。并將每個(gè)時(shí)期的子房分成3部分，分別進(jìn)行環(huán)切子房、去除子房壁和直接剝離胚珠3種處理，作為外植體分別放入不同的裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行接種培養(yǎng)。

1.2.2 適宜培養(yǎng)基的篩選

以H培養(yǎng)基［20］、吳伯驥等［17］改良的H培養(yǎng)基（用HW表示）和N6培養(yǎng)基［21］為基礎(chǔ)，對胚珠離體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)置5 種優(yōu)化培養(yǎng)基配方，見表1。采用上述環(huán)切子房、去除子房壁的子房和直接剝離的胚珠作為外植體進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，從中篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基并用于單倍體誘導(dǎo)。

1.2.3 再生單倍體植株的誘導(dǎo)

采用篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基和最適宜的外植體進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，并根據(jù)胚狀體誘導(dǎo)實(shí)際情況結(jié)合前人研究經(jīng)驗(yàn)，對培養(yǎng)基配方進(jìn)行微調(diào)整，以利于再生芽的誘導(dǎo)。以5種優(yōu)化培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)基配方微調(diào)設(shè)置5個(gè)處理：①培養(yǎng)基中不加激素、無機(jī)鹽濃度減半、不加激素且無機(jī)鹽濃度減半，共3種配方。②將培養(yǎng)基中的蔗糖濃度由20 g/L 增加到40 g/L；③將培養(yǎng)基中的瓊脂濃度由8 g/L增加到10 g/L；④將培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素濃度由2 mg/L降低到1.5 mg/L；⑤將培養(yǎng)基的pH 由5.5 提高到5.8。確定最終的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方和再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)移到最終確定的再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生再生芽。最后，將再生芽分植于附加有IAA 10 mg/L的H培養(yǎng)基或N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得再生植株。

于28 ℃光照培養(yǎng)室中，每天在1 500 lx 連續(xù)光照培養(yǎng)10 h 的條件下進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)、再生芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)。

1.2.4 再生單倍體植株的鑒定

于再生植株長至2～3 cm 高或3～4 片葉時(shí)，取再生植株葉片，利用流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國BD 公司）進(jìn)行倍性確定。具體方法：取再生植株約1.3～1.6 cm2幼葉，在0.5 mL 的細(xì)胞裂解液（Tris-HCl buffer，pH=7.2）中用刀片切碎，把樣品和溶液混合物通過孔徑30 μm 微孔膜過濾到測試管中，加20μL DAPI染色液［137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，0.4 μg Propidium iodide（PI,美國Sigma 公司），1 g/L tritonX-100 和4 μg RNAse A］染色15 min，然后上樣。以正常的子房供體植株DNA含量作為對照，調(diào)節(jié)到40 Channels。每個(gè)曲線峰至少分析10 000個(gè)細(xì)胞，重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 未受精胚珠培養(yǎng)適宜發(fā)育時(shí)期的確定

通過石蠟切片（圖2）觀察可知，5 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（即K1～K5）的花蕾子房內(nèi)胚珠的發(fā)育情況大體是：K1—成熟胚囊；K2—四核和八核期；K3—二核期；K4—單核期；K5—大孢子母細(xì)胞時(shí)期。

圖2 不同發(fā)育階段胚珠的胚囊發(fā)育情況Fig.2 Development of embryo sac of ovule at different development stages

將子房消毒后，采用幾種不同方式的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，包括環(huán)切子房、去除子房壁和直接剝離胚珠后進(jìn)行接種培養(yǎng)。環(huán)切子房接種培養(yǎng)7 d 后可觀察到外露的胚珠明顯膨大，帶有子房壁的外植體子房壁變綠增厚，未觀察到子房壁破裂現(xiàn)象，內(nèi)部胚珠基本沒有膨大跡象，此時(shí)將子房壁去除在培養(yǎng)過程中胚珠仍然褐化死亡；去除子房壁和直接剝離胚珠后進(jìn)行接種培養(yǎng)7 d 后能觀察到胚珠明顯增大。不同發(fā)育時(shí)期胚珠在培養(yǎng)過程中膨大的外植體率如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)過程中不同發(fā)育時(shí)期胚珠膨大的外植體率Fig.3 Expanded explant rate of ovule at different development stages during culture

由圖3可知，在不同培養(yǎng)基中從K1至K5各發(fā)育時(shí)期的胚珠膨大的外植體率均呈上升趨勢。發(fā)育時(shí)期為K5的胚珠在不同培養(yǎng)基上均表現(xiàn)最佳，所有外植體基本都存在胚珠膨大，且膨大的胚珠比例最高。所以，在所試驗(yàn)范圍內(nèi)胚囊發(fā)育越成熟，胚珠的增殖誘導(dǎo)越差。綜合來看，胚珠發(fā)育處于K3～K5時(shí)期接種情況最好，即取發(fā)育在大孢子母細(xì)胞時(shí)期到二核期之間的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)最佳。因此，應(yīng)摘取發(fā)育較早的花蕾，進(jìn)而采集發(fā)育時(shí)期較早的胚珠較有利于培養(yǎng)。

2.2 未受精胚珠培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用表1中的5種培養(yǎng)基培養(yǎng)未受精胚珠，結(jié)果（圖4）表明，培養(yǎng)基CM1、CM2、CM4 的培養(yǎng)效果均較佳，且以CM1的培養(yǎng)效果最佳?；九囵B(yǎng)基同為HW時(shí)，附加有細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基（CM4）的誘導(dǎo)效果比附加有KT 的培養(yǎng)基（CM2）略好。培養(yǎng)基CM1 和CM2 都能通過直接發(fā)生途徑誘導(dǎo)出大量的胚狀體，而胚珠在CM4（附加IAA 0.5 mg/L +6-BA 2 mg/L）培養(yǎng)基上并不直接產(chǎn)生胚狀體，而是先形成愈傷組織再分化成胚狀體，即通過間接途徑出苗，延長了胚狀體誘導(dǎo)的時(shí)間。N6培養(yǎng)基上除K5時(shí)期的胚珠外，其他外植體產(chǎn)生膨大胚珠的比例極小，而且外植體褐化死亡現(xiàn)象嚴(yán)重。而加有活性炭的培養(yǎng)基CM3 培養(yǎng)效果最差，若外植體為子房，則僅見子房壁變綠增厚，但無論外植體為子房還是胚珠，均未見有明顯膨大的胚珠。

圖4 不同培養(yǎng)基對煙草雄性不育雜交種KRK26未受精胚珠的培養(yǎng)效果Fig.4 Effects of different media on culture of unfertilized ovules of tobacco male sterile hybrid KRK26

2.3 再生單倍體植株的誘導(dǎo)

采用KRK26 未授粉的K3～K5 時(shí)期花蕾，直接剝?nèi)∨咧榻臃N于培養(yǎng)基CM1 上，15 d 后可見胚珠明顯膨大（圖5A）；培養(yǎng)30 d后得到胚狀體。

圖5 未受精胚珠誘導(dǎo)單倍體再生植株的過程Fig.5 Induction of regeneration of haploid plants from unfertilized ovules

將獲得的胚狀體繼續(xù)培養(yǎng)14 d 左右，胚狀體開始伸長，明顯形成兩極（圖5B）；隨后，大部分極性胚分化至類似子葉胚狀，有少數(shù)外形類似小苗（圖5C和5D）；將小苗分植于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行促根培養(yǎng)（圖4E）；培養(yǎng)14 d左右再生芽開始生根，長勢良好，培養(yǎng)20 d左右可見完整的再生植株（圖5F和5G）。

本試驗(yàn)中，一些胚狀體出現(xiàn)玻璃化。為此，嘗試通過提高蔗糖濃度（20→40 g/L），pH（5.5→5.8）和瓊脂濃度（8→10 g/L），同時(shí)降低細(xì)胞分裂素濃度（2→1.5 mg/L）來抑制玻璃苗的發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這幾種方法都能抑制玻璃苗的發(fā)生，但除了10 g/L 瓊脂濃度的培養(yǎng)基對生長無影響外，其他的培養(yǎng)基都對胚狀體生長不利。因此，在胚狀體和再生芽誘導(dǎo)中，將CM1培養(yǎng)基中的瓊脂濃度調(diào)整為10 g/L。

CM1培養(yǎng)基雖然能通過直接發(fā)生途徑誘導(dǎo)出大量的胚狀體，但胚狀體在培養(yǎng)過程中逐漸褐化，為此，嘗試了將胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素的1/2 CM1（即CM1 培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度減少一半）和不加激素的CM1 培養(yǎng)基（即H 培養(yǎng)基）上繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)基CM1 中激素去除能有效抑制胚狀體的褐化。同時(shí)，胚狀體能伸長并長出須狀葉，緩慢發(fā)育，部分處于K3、K4、K5時(shí)期胚珠誘導(dǎo)出的胚狀體在不含激素的CM1 培養(yǎng)基（即H 培養(yǎng)基）上逐漸發(fā)育成瘦弱的小苗（即再生芽）。隨后，將再生芽轉(zhuǎn)入附加有IAA 10 mg/L 的H 培養(yǎng)基或N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)再生芽能夠很快生根，長勢良好，進(jìn)而獲得大量的再生植株。

2.4 單倍體的鑒定與植株表現(xiàn)

通過胚珠培養(yǎng)得到了大量植株，因植株形態(tài)各異，不能確定再生植株的倍性，因此采用流式細(xì)胞儀對再生植株進(jìn)行倍性鑒定（圖6）。鑒定結(jié)果（圖7A）發(fā)現(xiàn)，大部分植株為單倍體植株。在檢測的855株再生植株中有647株為單倍體植株，單倍體植株率達(dá)到75.67%，其中尤以源于大孢子母細(xì)胞時(shí)期胚珠的再生植株中單倍體植株率最高，達(dá)到77.91%。所有的單倍體植株的幼苗長勢均緩慢，葉片數(shù)量、大小以及株高遠(yuǎn)不如親本植株。部分單倍體植株在培養(yǎng)基中長時(shí)間培養(yǎng)后出現(xiàn)頂芽壞死現(xiàn)象（圖7B）。將單倍體植株移入溫室中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單倍體植株長勢較弱（圖7C），但也能正常開花，為雄性不育（圖7D）。

圖6 再生單倍體植株的形態(tài)及流式細(xì)胞儀倍性鑒定Fig.6 Morphology of regenerated haploid plants and identification of their ploidy by flow cytometry

圖7 KRK26未受精胚珠培養(yǎng)獲得的單倍體植株長勢與開花Fig.7 Growth and flowering of haploid plants obtained from unfertilized ovule culture of KRK26

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，在合適條件下培養(yǎng)未受精的煙草胚珠可以長成植株，而且能不經(jīng)愈傷組織直接長成植株，這樣可以避免經(jīng)過愈傷組織而產(chǎn)生染色體的多樣畸變。這與祝仲純等［14］、吳伯驥等［17］的研究結(jié)果一致。但他們是用未授粉子房直接誘導(dǎo)的，而本試驗(yàn)中采用未授粉子房誘導(dǎo)時(shí)，觀察到子房壁變綠增厚，但內(nèi)部胚珠基本沒有膨大跡象，此時(shí)將子房壁去除后在培養(yǎng)過程中胚珠仍然褐化死亡。若采取去除子房壁再接種或直接剝?nèi)∨咧榻臃N，則能夠觀察到胚珠膨大，分化成許多極性胚，并逐漸長成植株。這可能是由于本試驗(yàn)中使用的是雄性不育材料所致。

祝仲純等［14］和吳伯驥等［17］在花粉單核晚期或雙核期時(shí)采集未授粉子房培養(yǎng)，能夠取得較好的誘導(dǎo)效果，得到再生植株。但本試驗(yàn)中采用的是雄性不育材料，無法根據(jù)花粉發(fā)育時(shí)期判定采集外植體的時(shí)期，因此采用花蕾外觀來評判胚珠的發(fā)育時(shí)期。胚囊發(fā)育越成熟，胚珠的增殖誘導(dǎo)能力越差，以發(fā)育在大孢子母細(xì)胞時(shí)期到二核期之間的胚珠，也就是發(fā)育較早的花蕾即花朵的花冠即將露出花萼時(shí)期至花冠比花萼長1 倍時(shí)期的胚珠誘導(dǎo)能力最佳。該時(shí)期胚珠培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體的起源可能有3種情況，一是直接起源于大孢子母細(xì)胞，大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂，再增殖形成細(xì)胞團(tuán)，再發(fā)育成胚狀體；二是起源于大孢子細(xì)胞，大孢子分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)，再發(fā)育成胚狀體；三是起源于卵細(xì)胞，胚珠接種后會(huì)遵循胚囊發(fā)育途徑形成正常的成熟胚囊，再由其中的卵細(xì)胞發(fā)育成胚狀體［10］。

祝仲純等［18］曾用N6培養(yǎng)基得到很好的培養(yǎng)結(jié)果，但本試驗(yàn)中采用N6培養(yǎng)基（CM5），除K5 時(shí)期胚珠外其他外植體產(chǎn)生膨大胚珠的比例極低，外植體褐化死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，未能得到再生植株。原因可能為：①基本培養(yǎng)N6的營養(yǎng)成分與H 培養(yǎng)基相比有較大不同；②瓊脂的濃度相比于其他類型培養(yǎng)基高出2 g/L，配制的培養(yǎng)基偏硬，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；③蔗糖的濃度為80 g/L，比其他類型培養(yǎng)基高3 倍。蔗糖在培養(yǎng)中除提供碳源外另一個(gè)重要的作用是調(diào)節(jié)滲透壓，影響細(xì)胞對物質(zhì)的吸收。潘莉等［22］也證實(shí)蔗糖濃度高于40 g/L 時(shí)會(huì)抑制胚狀體的誘導(dǎo)，在黃瓜未受粉子房培養(yǎng)中有研究表明蔗糖濃度低有利于胚囊內(nèi)細(xì)胞的分裂增殖［23］。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基CM1 培養(yǎng)效果最好，其次是CM2 培養(yǎng)基，采用這兩種培養(yǎng)基均可通過直接途徑得到單倍體再生植株。這與祝仲純等［14-16］、吳伯驥等［17］的研究結(jié)果一致。胚珠在CM4培養(yǎng)基（IAA 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L）的發(fā)育也較好，可以通過間接途徑出苗，這與潘莉等［19］報(bào)道的結(jié)果一致。煙草未授粉胚珠培養(yǎng)分為直接途徑和間接途徑，直接途徑就是胚珠直接發(fā)育成胚狀體再成苗，而間接途徑是先形成愈傷組織再分化成胚狀體，最后成苗［19］。在供試的各種培養(yǎng)基中，加有活性炭的培養(yǎng)基CM3培養(yǎng)效果最差，其原因有待于進(jìn)一步探討。

本研究中所獲得的單倍體植株的幼苗長勢緩慢，葉片數(shù)量和大小以及株高遠(yuǎn)不如親本植株。因此，在對再生植株進(jìn)行倍性鑒定時(shí)，可根據(jù)再生植株幼苗的長勢長相，預(yù)先淘汰掉明顯不是單倍體的植株，僅對長勢緩慢，葉片數(shù)量和大小以及株高遠(yuǎn)不如親本的再生植株進(jìn)行倍性鑒定，可減少工作量。但如何將獲得的單倍體植株高頻率地加倍成雙二倍體，并能快速繁殖，尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

以煙草雄性不育雜交種KRK26為材料，建立了從雄性不育煙草未受精胚珠誘導(dǎo)單倍體植株的培養(yǎng)體系。采集發(fā)育階段處于大孢子母細(xì)胞時(shí)期到二核期之間的胚珠，即花朵的花冠將露出花萼時(shí)期至花冠比花萼長1倍時(shí)期的胚珠作為外植體，接種于附加生長素IAA 0.5 mg/L 和細(xì)胞分裂素KT 2 mg/L 的H培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的終濃度分別是20 g/L 和10 g/L；將產(chǎn)生的胚狀體轉(zhuǎn)移到不含激素的H 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生再生芽，再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的終濃度同樣分別為20 g/L 和10 g/L；將形成的再生芽分植于附加生長素IAA 10 mg/L的H培養(yǎng)基或N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以促進(jìn)再生芽生根，獲得再生植株，再生芽生根培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的終濃度分別是80和8 g/L。最后，對再生植株進(jìn)行倍性鑒定，挑選出單倍體植株以進(jìn)行加倍。