尚可，楊盛智，劉旭，宋佳蓉，范振鑫，岳碧松，李靜

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610065）

獼猴Macaca mulatta是生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的非人靈長類動物，目前已在國內(nèi)廣泛圈養(yǎng)。腹瀉是一類廣泛發(fā)生的威脅圈養(yǎng)獼猴健康的疾病（顧宏偉，2021），其中，炎癥性腸病是最普遍的慢性腹瀉疾病，發(fā)病機制復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)，尤其是腸道菌群被認(rèn)為可能是腹瀉易感性的主要因素（Fournieret al.，2020）。目前，猴場大多采取投喂廣譜性抗生素的形式治療慢性腹瀉，但臨床發(fā)現(xiàn)，該方式的治療效果并不明顯，且長期使用抗生素易使腸道致病菌產(chǎn)生耐藥性，且有引發(fā)抗生素相關(guān)性腹瀉的風(fēng)險。因此，尋找抗生素的有效替代品，成為了生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注焦點。

益生菌是指存在于腸道中的一類擁有維持腸屏障完整性、釋放營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、平衡促炎因子和抗炎因子等功能的活性微生物（高可染等，2022）。益生菌與各類人類及動物疾病，如腸道疾病、糖尿病、心血管疾病及癌癥等都密切相關(guān)（Varshaet al.，2021）。適當(dāng)補充有益細(xì)菌后可使腸炎病情得到不同程度的緩解（張瑛，2010）。乳酸菌是人類和動物腸道菌群的主要組成部分之一，也被認(rèn)為是一類經(jīng)典的益生菌，具有調(diào)節(jié)胃腸道微生物組成、輔助治療胃腸和其他多種疾病的功能。如一株泡菜源乳酸菌對酸誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎具有較強的抗炎活性，解剖學(xué)和組織病理學(xué)顯示口服補充乳酸菌可改善急性結(jié)腸炎的癥狀（Sooet al.，2017）。某些乳酸菌菌株可產(chǎn)生維生素，它們在預(yù)防和治療結(jié)腸炎、黏膜炎等炎癥性疾病方面顯示出了很好的效果（LeBlancet al.，2020）。

本課題組先前自健康獼猴糞便樣品中分離獲得了一株唾液乳桿菌Lactobacillus salivariusMK0901，本研究一方面探究了其體外益生特性，如溶血性、抗生素抗性、耐酸性、耐膽鹽性、細(xì)胞黏附性和抑菌性等；另一方面，采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導(dǎo)法構(gòu)建結(jié)腸炎小鼠模型，以益生性已被廣泛研究和認(rèn)可的鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusGG（LGG）作為陽性菌株，研究了該菌株對結(jié)腸炎癥狀的改善和動物腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，從而全面評價其益生活性。

1 材料

1.1 實驗菌株和細(xì)胞系

唾液乳桿菌MK0901 來自本課題組菌種庫。溶血性葡萄球菌Staphylococcus haemolyticusATCC29970、大腸埃希氏菌Escherichia coliCMCC（B）44102、乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella enterica serovarParatyphi B CMCC（B）50094、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCC（B）26003、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC（B）10104 和鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosusATCC 53103購自益加生物科技成都有限公司。人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29）細(xì)胞系由本學(xué)院細(xì)胞室提供。

1.2 實驗動物

由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供4 周齡SPF 級雄性昆明小鼠60 只［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030］，平均體重28.86 g，體重間無顯著性差異。飼養(yǎng)于本實驗室動物房中，實驗流程按四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會相關(guān)要求進行。正式實驗前進行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：濕度50%左右，溫度24 ℃左右，每日光照與黑暗各12 h，及時添加飼料和飲用水，自由飲食飲水。

1.3 主要試劑

無菌DPBS 緩沖液、4%多聚甲醛固定液、氯化鈉（分析純）（白鯊生物），MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板（環(huán)凱生物），人工胃液、人工腸液、抗生素藥敏紙片（四環(huán)素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、克林霉素、克拉霉素、慶大霉素、氯霉素）（上海源葉生物），葡聚糖硫酸鈉（翌圣生物），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒（江蘇晶美生物），糞便DNA 提取試劑盒（天根生化科技）。

1.4 主要儀器及設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安）、生化培養(yǎng)箱（三洋電機）、無菌操作臺（浙江蘇凈）、多功能酶標(biāo)儀（Bio Tek）、超低溫冰箱（海爾）。

2 方法

2.1 體外益生性評估

2.1.1 溶血性 將復(fù)蘇、活化的MK0901 接種于哥倫比亞血平板，培養(yǎng)24 h 后觀察其是否出現(xiàn)溶血環(huán)，并以溶血性葡萄球菌作為陽性對照。

2.1.2 耐酸、耐膽鹽性和耐人工胃、腸液能力將單菌接種于pH3.0 和豬膽鹽濃度0.3%的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，吸取1 μL菌液點于MRS 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀測其是否結(jié)菌。確認(rèn)可結(jié)菌后，將單菌接種于人工胃液中，菌液濃度調(diào)至約108CFU·mL-1，37 ℃培養(yǎng)3 h，用梯度稀釋法進行活菌計數(shù)，同時吸取1 mL 培養(yǎng)的人工胃液于9 mL 的人工腸液中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h 后，再次進行活菌計數(shù)，并計算人工胃、腸液存活率。

2.1.3 抗生素抗性 使用無菌棉花蘸取菌液（濃度108CFU·mL-1）并均勻涂布于MRS 瓊脂平板上。將抗生素藥敏紙片貼于MRS 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測定藥敏圈直徑。

2.1.4 細(xì)胞黏附性 挑單菌落接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培 養(yǎng)24 h 后5 000 r·min-1離 心10 min，用PBS 緩沖液沖洗，將菌液濃度調(diào)至106CFU·mL-1。采用細(xì)菌與細(xì)胞共培的方法測試MK0901 對HT-29 的黏附性，培養(yǎng)時間為2 h（黏附率=共培后菌液濃度/共培前菌液濃度×100%）。

2.1.5 抑菌性 大腸埃希氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于TSB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。配制400 mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至40 ℃左右，加入1 mL病原菌培養(yǎng)液，混勻后倒平板，待其凝固后用6 mm打孔器打孔，每孔加50 μL MK0901 發(fā)酵液上清，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑。

2.2 對結(jié)腸炎小鼠的作用

2.2.1 結(jié)腸炎小鼠造模和動物分組 將試驗菌株MK0901 與陽性對照菌株LGG 復(fù)蘇并活化。將其置于-4 ℃、6 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，收集菌泥。使用無菌PBS 緩沖液重懸菌體，調(diào)節(jié)菌液濃度達(dá)109CFU·mL-1，配制為灌胃用菌懸液，備用。60 只昆明雄性小鼠隨機分為4 組：空白對照組（CK 組）、模型組（DSS 組）、LGG 組和MK0901 組。實驗周期共16 d，分為造模期（8 d）和恢復(fù)期（8 d）。整個實驗周期中，空白組每日提供正常水，自由飲用，每日每只小鼠灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水；實驗組小鼠在造模期每天提供4%DSS自由飲用，在恢復(fù)期自由飲用正常水，每日每只DSS 組小鼠灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水，其余2 組則分別灌胃0.2 mL上述MK0901或LGG菌懸液。

2.2.2 小鼠體重變化率及免疫器官指數(shù)測定每日稱量小鼠體重并繪制其變化曲線。實驗結(jié)束日脫頸處死小鼠，迅速取出脾臟并用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱量。脾臟指數(shù)=脾臟重量（g）/小鼠體重（g）×100%。

2.2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn) 取小鼠結(jié)直腸，以盲腸為辨識標(biāo)志測量其長。截取1 cm 結(jié)腸并用4%多聚甲醛固定液將其固定24 h。采用HE 染色法進行制片。用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)表現(xiàn)。

2.2.4 血清炎癥因子測定 采用眼眶取血法獲得小鼠新鮮血樣，將血樣置于3 000 r·min-1離心10 min，收集血清。使用TNF-α、IL-1β 和IL-6 檢測試劑盒，按照說明書測定炎癥因子指標(biāo)。

2.3 對結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

使用糞便基因組DNA 試劑盒提取糞便總DNA。使用PCR 擴增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4 高變區(qū)，擴增引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCA GCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。采用Illumina MiSeq PE250平臺完成16S rRNA基因擴增子測序，使用美吉生信云分析平臺（https：//cloud.majorbio.com/）完成數(shù)據(jù)質(zhì)控及分析。以相似度不低于97%為標(biāo)準(zhǔn)對物種序列進行聚類分析，統(tǒng)計各組OTU 數(shù)目；采用QIIME 中“diversity alpha-group-significance”計算Alpha 多樣性指數(shù)；ggplot2 和vegan 包完成主坐標(biāo)分析；物種豐度分析由ggplot2完成。

3 結(jié)果

3.1 MK0901體外評估結(jié)果

MK0901 的單菌落在哥倫比亞血平板上未形成溶血環(huán)，可耐受長達(dá)18 h 的高酸、高膽鹽環(huán)境，且在耐受3 h 人工胃、腸液后的存活率為94.3%和92.7%。抗生素抗性測試結(jié)果表明，MK0901 對四環(huán)素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、克林霉素、克拉霉素、氯霉素均表現(xiàn)為敏感，僅對慶大霉素表現(xiàn)為耐藥。細(xì)胞黏附性結(jié)果顯示，MK0901 對HT-29的黏附率達(dá)到87.5%。此外，MK0901對大腸桿菌、沙門氏菌和金色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有一定抑制作用（表1）。綜上，唾液乳桿菌MK0901 具有良好的安全性和體外益生特性，具備益生菌開發(fā)潛力。

3.2 MK0901對小鼠結(jié)腸炎的作用

3.2.1 小鼠體重及免疫器官指數(shù)測定結(jié)果 經(jīng)DSS 溶液處理的3 組小鼠平均體重均低于CK 組，尤其是DSS 組，平均體重最低。至恢復(fù)期結(jié)束（第16 天），MK0901 組和LGG 組的平均體重均比DSS 組高。MK0901 組和LGG 組的平均脾臟指數(shù)比DSS 組低，與CK 組相近，但并無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

表2 各組小鼠的平均體重和脾臟指數(shù)對比Table 2 Comparison of average body weight and spleen index of mice in each group

3.2.2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 組織切片顯示，CK 組腸黏膜組織完整，未見潰瘍，黏膜可見淋巴濾泡形成（圖1：a）；DSS組結(jié)腸黏膜及肌層變薄，腺體層次減少，腸腔擴張，局部潰瘍形成，表面未見腺上皮被覆，其下出血及小血管增生（圖1：b）；與CK 組相比，LGG 組（圖1：c）和MK0901 組（圖1：d）的黏膜和肌層稍變薄，腺體層次減少，腸腔擴張，但較DSS 組而言，未出現(xiàn)明顯潰瘍，黏膜僅見少許慢性炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 小鼠結(jié)腸HE染色圖（×400）Fig.1 HE staining diagram of mouse colon （×400）

3.2.3 MK0901 對小鼠血清炎癥因子水平的影響 與CK 組相比，DSS 組的3 種炎癥因子水平都顯著（IL-1β：P＜0.05）或極顯著升高（TNF-α和IL-6：P＜0.01），而LGG 組和MK0901 組的均有所下降，其中，TNF-α 水平的差異不顯著。MK0901 組與LGG 組的TNF-α 和IL-6 水平均極顯著低于DSS 組（P＜0.01），但MK0901 組的IL-1β 水平與CK 組的差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

圖2 小鼠炎癥因子水平Fig.2 Levels of inflammatory factors in mice

3.2.4 MK0901 對結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響MK0901 組的Shannon 指數(shù)最高；LGG 組的Ace 和Chao 指數(shù)最高；3 個多樣性指數(shù)均是DSS 組最低（圖3：A～C）。OTU 聚類結(jié)果顯示，4 組樣品的OTU數(shù)目為513～617 個，其中，DSS 組的最少（513），MK0901 組的最多（617）；4 組特有的OTU 數(shù)目為115～174個，其中，MK0901組最豐富（圖3：D）。

圖3 各組樣品的菌群結(jié)構(gòu)差異Fig.3 Bacterial structure difference of samples from each group

主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，PC1 與PC2 之和達(dá)53.98%（＞50%），DSS 組的菌群結(jié)構(gòu)與其余3 組的差異最大，而LGG 組和MK0901 組則趨近于CK 組（圖3：E）。

物種堆積圖顯示，在門水平上，擬桿菌門Bacteroidota和厚壁菌門Firmicutes是各組主要菌群門類。DSS 組中，擬桿菌門占據(jù)明顯優(yōu)勢（P=70.98%），而厚壁菌門的比例最低（P=25.24%）（圖3：F）。在屬水平上，各組優(yōu)勢的前2 個屬均為乳桿菌屬Lactobacillus和隸屬于Muribaculaceae 的某屬。除CK 組外，其余組均包含較高比例的擬桿菌屬Bacteroides，尤其是DSS 組，比例達(dá)到16.34%。與其他組相比，MK0901組含較多的毛螺旋菌科Lachnospiraceae和普雷沃氏菌科Prevotellaceae 成員，豐度分別為7.41%和5.45%（圖3：G）。

4 討論

作為抗生素替代品，益生菌近年來在人類和動物健康領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，其被認(rèn)為擁有提高免疫力、緩解炎癥、增加營養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)整腸道菌群等功效。安全性是篩選益生菌的重要指標(biāo)，不具備溶血活性及對常見抗生素類型敏感是益生菌可服用的前提（馮程程等，2022）。當(dāng)益生菌進入宿主體內(nèi)后，會遭遇胃腸液環(huán)境中的高酸和高濃度膽鹽脅迫，極有可能失去活性，因此，具備良好的胃腸環(huán)境耐受性才可保證益生菌發(fā)揮其益生性能。作為外源性細(xì)菌，益生菌對宿主腸道上皮細(xì)胞要有一定的黏附能力，才能定植于機體，進而調(diào)節(jié)微生態(tài)環(huán)境，并抵抗致病菌的侵襲（魏雪等，2022）。本研究顯示唾液乳桿菌MK0901 在以上評估中均表現(xiàn)良好，還對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌等常見的腸道致病菌具有抑菌活性，展示了良好的安全性和益生特性。

MK0901 對結(jié)腸炎動物模型也顯示出良好的修復(fù)活性。灌胃MK0901 有助于結(jié)腸炎小鼠恢復(fù)體重，恢復(fù)效果與公認(rèn)的益生菌株LGG 的效果相當(dāng)。脾是機體重要的免疫器官（吳濤等，2022），脾腫大則脾臟指數(shù)上升，表明存在炎癥反應(yīng)。雖然MK0901 組和LGG 組小鼠的脾臟指數(shù)與DSS 模型組的差異不顯著，但DSS 組的平均脾臟指數(shù)高于MK0901 組和LGG 組，表明2 個菌株都具有一定緩解脾臟腫大的功效。結(jié)腸病理組織切片顯示，MK0901 和LGG 菌在一定程度上保護了腸道組織，抵抗了DSS對結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的損害作用，降低了潰瘍和炎癥的程度。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 是檢測機體免疫狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)（李青松等，2022）。益生菌可通過抑制炎癥信號通路，從而降低促炎因子的表達(dá)量（齊從虎，楊景玉，2017；王呂斌，錢軍，2019；Liet al.，2021）。本研究也發(fā)現(xiàn)MK0901 與LGG 對3 種促炎因子均具可極顯著降低TNF-α 和IL-6 水平，而對IL-1β 水平的降低作用不明顯，同時發(fā)現(xiàn)MK0901 降低IL-1β炎癥因子的效果要優(yōu)于LGG菌株。

腸道菌群多樣性和組成的變化與結(jié)腸炎等腸道疾病關(guān)系密切。4組小鼠糞便微生物的16S rRNA測序分析顯示，MK0901 組的Shannon 指數(shù)最高，LGG 組的Ace 和Chao 指數(shù)最高，表明灌胃益生菌可緩解由DSS 造成的腸道菌群多樣性的下降。從腸道微生物組成上，MK0901 組具有最高的菌群總數(shù)及最多的獨有菌群，這與其最高Shannon指數(shù)的結(jié)果一致。PCoA 顯示MK0901 組與LGG 組與空白對照組的菌群組成更加相似，而DSS組則表現(xiàn)出較大差異，這表明2株益生菌都可調(diào)節(jié)宿主腸道微生物結(jié)構(gòu)，使之恢復(fù)正常。莫曉瑋等（2022）研究顯示，擬桿菌屬的豐度能反映結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，且兩者呈正相關(guān)。這與本研究結(jié)果一致，DSS模型組擬桿菌屬相對豐度高于CK 組，而MK0901 組和LGG組介于CK 組與DSS 組之間，表明2株益生菌都能緩解腸炎癥狀。此外，MK0901 處理后使毛螺旋菌科和普雷沃氏菌科細(xì)菌豐度增加。毛螺旋菌科具有水解糖和產(chǎn)生短鏈脂肪酸的作用，而短鏈脂肪酸在維持和修復(fù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)、保障腸道功能正常運作及防止炎癥和潰瘍發(fā)生等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用（楊立娜等，2022）。普雷沃氏菌科下的諸多成員被認(rèn)為具有重要的營養(yǎng)功能，其能降解蛋白質(zhì)和碳水化合物，并在一定程度上改善腸道微環(huán)境（Asgharianet al.，2022）。

唾液乳桿菌MK0901 顯示出優(yōu)良的體外益生特性，同時針對患結(jié)腸炎動物，該菌株具有維持體重、降低炎癥水平、保護腸道組織及調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等功效，是非常具有開發(fā)潛力的益生菌候選菌株，為防治圈養(yǎng)獼猴由炎癥性腸病引起的慢性腹瀉提供了一個潛在的解決方案。

致謝：感謝四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張修月教授對本研究的支持和幫助，感謝益生菌團隊成員楊宇、黃飛云、李嘉偉、夏雪及鄭苗苗等對實驗實施的幫助。