倫琦 喬鏡澄 楊江南 劉海濤 武湘姝 文文

摘 要：以乙醇為浸提液，利用微波萃取輔助超聲法提取銀杏葉中總黃酮類化合物，通過單因素試驗以及響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，黃酮類化合物的最佳提取條件為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1（mL∶g）、微波時間3.83 min，該條件下銀杏葉中黃酮化合物提取量為28.36 mg·g-1。

關(guān)鍵詞：銀杏葉；黃酮；響應(yīng)面分析法；工藝優(yōu)化

Abstract： The total flavonoids in Ginkgo biloba leaves were extracted by microwave extraction-assisted ultrasonication using ethanol as the extracting solution， and the extraction process was optimized by single-factor test and response surface test design. The results showed that the optimum extraction conditions for flavonoids were 63.15% ethanol concentration， 2.65 min ultrasonic time， 116∶1 （mL∶g） liquid-to-material ratio and 3.83 min microwave time， and the extraction amount of flavonoids in Ginkgo biloba leaves was 28.36 mg·g-1 under these conditions.

Keywords： Ginkgo Biloba leaves; flavonoid; response surface methodology; optimization

銀杏葉提取物復(fù)雜的化學(xué)成分中主要起藥理活性作用的是黃酮類物質(zhì)，其黃酮種類多達(dá)40種。黃酮類化合物生理活性多種多樣，具有治療心血管系統(tǒng)疾病、抗致病菌、消除炎癥、抗氧化、預(yù)防腫瘤等多重功效[1]。當(dāng)前，銀杏葉總黃酮的提取方法有超聲輔助提取法[2]、超聲酶輔助提取法[3]和微波輔助提取法[4-5]等。研究表明，超聲波輔助提取法較強(qiáng)的空化效應(yīng)可以破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，加速物質(zhì)的溶出。微波輔助提取法使得黃酮類化合物溶解性提高，有利于提取率的增加。當(dāng)前，微波超聲聯(lián)合輔助提取銀杏葉黃酮報道較少。魏欣等[6]在提取棕櫚葉中酚酸時采用了微波超聲交替提取法，大大提高了提取效率。馮婧等[7]利用微波-超聲輔助聯(lián)合提取銀杏葉黃酮，提取率明顯提高，王娜等[8]利用超聲微波協(xié)同優(yōu)化花生紅衣原花青素的提取，其提取率也獲得明顯提高。因此本文采用微波-超聲輔助聯(lián)合提取法，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗條件，提高了銀杏葉黃酮的提取率，降低微波的功率以減少微波熱效應(yīng)對黃酮結(jié)構(gòu)的損傷，為天然產(chǎn)物的高效提取及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉：采自天津天獅學(xué)院校園；蘆丁為優(yōu)級純（中國藥品生物制品檢驗所，純度≥98%）；無水乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

SONICS超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，上海芃奇科技儀器有限公司；微波催化合成萃取儀，上海比朗儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計，費(fèi)爾伯恩實業(yè)發(fā)展（上海）有限公司；高速萬能粉粹機(jī)，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下電器有限公司。

1.3 總黃酮提取與測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和6 mL置于25 mL容量瓶內(nèi)，加蒸餾水至6 mL，加入5%亞硝酸溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度搖勻。測定OD510，繪制蘆丁與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 總黃酮提取

將烘干的銀杏葉磨成粉，過80目篩，保存在低溫避光的條件下。稱取銀杏葉粉末0.500 0 g，溶于60%乙醇，液料比120∶1（mL∶g），采用微波催化合成萃取儀處理，微波功率定為150 W，時間4 min。后置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中處理，超聲間隙為2 s、超聲時間為2 s，超聲功率228 W，時間3 min。離心轉(zhuǎn)速1 500 r·min-1，離心處理時間5 min，取上清液備用[4，7]。

1.3.3 總黃酮含量測定

量取樣品處理液2 mL，置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻，靜置6 min后，加10% Al（NO3）3溶液1 mL，混勻，靜置6 min。加4% NaOH試液10 mL，加水定容至刻度線，混勻，510 nm波長下測定吸光度。

1.3.4 總黃酮含量的計算

按1.3.1測得的吸光度值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.011 8x+0.002（R2=0.999 7），利用公式（1）計算總黃酮類化合物的提取量[7]。

式中：A為OD510處的吸光值；B為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為銀杏葉干粉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 乙醇濃度

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，乙醇濃度分別為50%、55%、60%、65%和70%，溶液50 mL，液料比為1∶120（g∶mL）在微波功率為150 W下微波處理4 min，在超聲功率228 W下超聲3 min，離心取上清液。

1.4.2 超聲處理時間

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為120∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50 mL，在微波功率為150 W下微波處理4 min，超聲功率為228 W，超聲處理時間分別是1 min、2 min、3 min、4 min和5 min，離心取上清液。

1.4.3 微波處理時間

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為120∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50mL，在微波功率為150 W下微波處理時間分別為2 min、3 min、

4 min、5 min和6 min，超聲功率228 W下超聲處理3 min，離心取上清液。

1.4.4 液料比

稱取0.500 g的銀杏葉粉末，液料比為60∶1、80∶1、100∶1、120∶1和140∶1（mL∶g），60%的乙醇溶液50 mL，微波功率為150 W，處理

4 min，在超聲功率228 W下超聲處理3 min，離心取上清液。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化方案

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法以黃酮類化合物提取量為響應(yīng)值，對黃酮化合物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得黃酮類化合物的最佳工藝參數(shù)[9]。水平因素設(shè)計如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度

由圖1可知，在液料比為120∶1（g∶mL），微波功率150 W下微波處理4 min，超聲功率228 W下超聲3 min的條件下，當(dāng)乙醇濃度60%時黃酮化合物提取量為26.57 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.2 超聲處理時間

圖2表明，在液料比為120∶1（g∶mL），乙醇濃度為60%，微波功率150 W下微波處理4 min，

超聲功率228 W條件下，當(dāng)超聲3 min時黃酮化合物提取量為28.36 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.3 微波處理時間

由圖3可知，在液料比為120∶1（g∶mL），乙醇濃度為60%，微波功率為150 W，超聲功率

228 W超聲處理3 min的條件下，當(dāng)微波處理時間為

4 min時黃酮化合物提取量為26.42 mg·g-1，此時提取量最高。

2.1.4 液料比

由圖4可知，在乙醇濃度為60%，微波功率150 W下微波處理4 min，超聲功率228 W超聲處理3 min的條件下，液料比不同時黃酮類化合物提取量不同。當(dāng)液料比為120∶1（mL∶g）時黃酮化合物提取量為26.60 mg·g-1，此時提取量最高。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 回歸方程及方差的分析

結(jié)合單因素實驗，利用Design expert 8.0軟件對乙醇濃度、超聲時間、液料比及微波時間4個因素來進(jìn)行響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表2、3所示。

得到銀杏葉黃酮類化合物總提取量Y（mg·g-1）對A、B、C、D的二次多項回歸方程為Y=28.36-0.016A-0.54B+0.55C-0.55D+0.048AC-0.087BC+0.14BD+0.042CD-0.25A2-0.93B2-1.19C2-1.53D2，得到此模型的P＜0.000 1，證明此模型極顯著，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.989 5，模型擬合度較好，相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.979 1，變異系數(shù)為0.6%，說明該回歸方程可以解釋97.91%的試驗數(shù)據(jù)。F=94.59，F(xiàn)值越大，變量對響應(yīng)值的影響就越大。可以認(rèn)為，該試驗中選取的4個因素對于銀杏總黃酮類的提取量具有一定的影響，可以利用該模型來得到銀杏葉黃酮的最佳提取條件。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖5為各因素對響應(yīng)值的影響，各因素對黃酮類化合物的影響的排序為D＞C＞B＞A，交互項對黃酮類化合物影響的排序為BD＞BC＞AC＞CD＞

AB=AD，二次項對黃酮類化合物影響的排序為D2＞C2＞B2＞A2，與方差分析結(jié)果相同。根據(jù)響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1、微波時間3.83 min，

預(yù)測的黃酮化合物提取量為28.38 mg·g-1。利用此最佳工藝條件提取銀杏葉內(nèi)的總黃酮，得到的黃酮類化合物提取量為28.36 mg·g-1，與預(yù)測值較為符合。

3 結(jié)論

本文運(yùn)用微波萃取輔助超聲聯(lián)合提取黃酮類化合物的方法顯著縮短了提取時間，提高了銀杏葉中黃酮類化合物的提取量。在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對銀杏葉中的黃酮類化合物提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝為乙醇濃度63.15%、超聲時間2.65 min、液料比116∶1（mL∶g）、微波時間3.83 min，此工藝條件下提取黃酮類化合物提取量為28.36 mg·g-1。

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