馬青彬 劉芳 梁芳 邢冬飛 孫娜

摘要：為研究乳酸菌聯(lián)合小球藻（Chlorella vulgaris）對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus plicatilis）種群增長(zhǎng)的影響，以盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司輪蟲(chóng)池冬卵孵化的輪蟲(chóng)為試驗(yàn)對(duì)象，以小球藻為輪蟲(chóng)基礎(chǔ)餌料并添加不同濃度的微生態(tài)制劑乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB），設(shè)置乳酸菌的濃度梯度為0（對(duì)照組）、1×10⁸cells/mL、2×10⁸cells/mL、5×10⁸cells/mL、10×10⁸cells/mL，連續(xù)觀察4d，對(duì)輪蟲(chóng)種群密度、抱卵率和平均增長(zhǎng)率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，在輪蟲(chóng)種群密度起始相同的情況下，添加適宜濃度的乳酸菌處理組輪蟲(chóng)最大種群密度、抱卵率和平均增長(zhǎng)率是同時(shí)期對(duì)照組的3倍、3倍和5倍（P＜0.05），且能有效降低培養(yǎng)水體pH使其在輪蟲(chóng)生長(zhǎng)適宜范圍內(nèi)。結(jié)果表明以小球藻為輪蟲(chóng)基礎(chǔ)餌料，添加一定濃度的乳酸菌有利于褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，可以提高輪蟲(chóng)的種群數(shù)量，促進(jìn)種群增長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）；褶皺臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus plicatilis）；小球藻（Chlorella vulgaris）；種群密度；種群增長(zhǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

褶皺臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus plicatilis）屬輪蟲(chóng)門(mén)，單卵巢綱，單巢目，游泳臂尾輪蟲(chóng)科，臂尾輪蟲(chóng)屬^[1-2]。其多數(shù)分布在鹽度較高的河口和近海區(qū)域，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)豐富、大小適中、適口性好、游動(dòng)緩慢等特點(diǎn)，可以大規(guī)模人工培養(yǎng)，適合作為水產(chǎn)動(dòng)物的開(kāi)口生物餌料^[3]。目前，輪蟲(chóng)可以作為60多種海水魚(yú)類(lèi)和近20種甲殼動(dòng)物的育苗活餌料。隨著種苗培育密度不斷提高，作為優(yōu)質(zhì)活餌料的海水輪蟲(chóng)的需求量也不斷增大，能否持續(xù)高效生產(chǎn)輪蟲(chóng)，已成為種苗培育成敗的關(guān)鍵因素。

近些年，微生態(tài)制劑也被應(yīng)用于褶皺臂尾輪蟲(chóng)的培育工作中。有研究表明，采用小球藻液、面包酵母和光合細(xì)菌混合培育出的褶皺臂尾輪蟲(chóng)效果較好^[4]；楊質(zhì)楠等^[5]證實(shí)在餌料中添加光合細(xì)菌對(duì)輪蟲(chóng)有促生長(zhǎng)作用；甘松永^[6]和肖佳華等^[7]也發(fā)現(xiàn)了利用芽孢桿菌作為餌料培養(yǎng)輪蟲(chóng)是可行的，且有利于輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)并提高輪蟲(chóng)的種群數(shù)量。以往研究多是光合細(xì)菌和芽孢桿菌等在輪蟲(chóng)培育中的應(yīng)用，而乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）用于輪蟲(chóng)培育的研究很少。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用乳酸菌聯(lián)合小球藻混合投喂輪蟲(chóng)，觀察其種群增長(zhǎng)變化，探究乳酸菌投喂輪蟲(chóng)的適宜濃度，為輪蟲(chóng)高效生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

褶皺臂尾輪蟲(chóng)由盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司輪蟲(chóng)池冬卵提供；培育海水為天然海水，鹽度20‰；微生態(tài)制劑乳酸菌由運(yùn)城市鹽湖區(qū)鴻翔水處理制藥廠生產(chǎn)；小球藻由盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司小球藻池提供。

1.2 方法

1.2.1 輪蟲(chóng)孵化

用輪蟲(chóng)冬卵進(jìn)行孵化，將輪蟲(chóng)卵放入裝有500mL、鹽度20‰的天然海水的燒瓶中，放置在生化培養(yǎng)箱中孵化，孵化溫度25℃，時(shí)間1d。孵化完成后，選取活力較好且不帶卵的輪蟲(chóng)按照2ind./mL的接種密度放入500mL燒杯中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)前，先將乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)。乳酸菌培養(yǎng)方法：稱(chēng)取1.25g菌粉、15g紅糖充分溶解到500mL蒸餾水中，培養(yǎng)溫度25℃，發(fā)酵1d后，測(cè)量pH在3～4之間可用，顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板定量乳酸菌濃度為5×10⁷ cells/mL。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將15個(gè)500mL燒杯分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行。每個(gè)燒杯均添加定量的小球藻，不同的乳酸菌添加量，混合均勻，在不充氣、不換水、水溫控制在25℃、光照正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每24hrs對(duì)燒杯中輪蟲(chóng)種群進(jìn)行取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算輪蟲(chóng)抱卵率P和平均增長(zhǎng)率R，并檢測(cè)其培養(yǎng)水體的水化指標(biāo)。分組情況見(jiàn)表1。

1.2.4 種群增長(zhǎng)相關(guān)的測(cè)定

每24hrs從每一個(gè)燒杯中隨機(jī)吸取1.0mL輪蟲(chóng)培養(yǎng)液，加碘液固定后計(jì)數(shù)每毫升培養(yǎng)液輪蟲(chóng)數(shù)量、輪蟲(chóng)卵數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.5 培養(yǎng)水體水化指標(biāo)的測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)水體pH，每一個(gè)燒杯測(cè)3次，取平均值。用便攜溶氧儀測(cè)定水體溶解氧。

1.2.6 試驗(yàn)計(jì)算

平均增長(zhǎng)率R：

N0表示實(shí)驗(yàn)初始輪蟲(chóng)種群密度；Nt表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)輪蟲(chóng)種群密度；t表示試驗(yàn)天數(shù)。

輪蟲(chóng)抱卵率P＝（輪蟲(chóng)卵的總數(shù)/輪蟲(chóng)總數(shù)）×100％

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較各試驗(yàn)組的種群密度、抱卵率、平均增長(zhǎng)率及水化指標(biāo)值的差異顯著性；用Duncan多重比較檢驗(yàn)對(duì)比各處理間的均值，差異顯著性水平（P）值設(shè)為0.05，結(jié)果采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)種群密度的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲(chóng)對(duì)其種群密度的影響變化見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在輪蟲(chóng)種群起始密度相同的情況下，從開(kāi)始到培養(yǎng)結(jié)束，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的種群密度增加，其中處理組D在培養(yǎng)時(shí)期種群密度都高于其他實(shí)驗(yàn)組，而處理組E在培養(yǎng)后期階段種群密度明顯小于其他實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)1d時(shí)，處理組D與其他組之間差異顯著（P＜0.05），種群密度明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，處理組B、C、E與對(duì)照組A之間差異不顯著（P＞0.05），種群密度相當(dāng)；培養(yǎng)2d時(shí)，處理組B、C、D、E與對(duì)照組A之間差異顯著（P＜0.05），處理組較對(duì)照組都有明顯的種群密度增多，其中處理組D與其他實(shí)驗(yàn)組有明顯的差異顯著（P＜0.05），其種群密度是同時(shí)期對(duì)照組A的3倍左右；培養(yǎng)3d時(shí)，處理組D與其他實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著（P＜0.05），是同時(shí)期對(duì)照組A種群密度的2.5倍左右，而處理組E的種群密度已經(jīng)低于其他實(shí)驗(yàn)組；培養(yǎng)4d時(shí)，處理組B、C、D、E之間差異顯著（P＜0.05），對(duì)照組A和處理組E之間也差異顯著（P＜0.05），且處理組E種群密度遠(yuǎn)低于對(duì)照組A，照組A和處理組B之間差異不顯著（P＞0.05），且種群密度接近。

2.2 乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)種群抱卵率的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲(chóng)對(duì)其種群抱卵率的影響變化見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，在種群起始密度均等的情況下，對(duì)照組和處理組的種群抱卵率整體都是呈上升然后下降趨勢(shì)，其中處理組D的種群抱卵率在培養(yǎng)期間明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)1d時(shí)，處理組C、D、E與對(duì)照組A之間差異顯著（P＜0.05），處理組D的種群抱卵率是對(duì)照組A的2.5倍，且在同時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組中抱卵率最高達(dá)到60%，處理組B和對(duì)照組A種群抱卵率相當(dāng)；培養(yǎng)2d時(shí)，處理組D與其他實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著（P＜0.05），其種群抱卵率達(dá)到80%，是同時(shí)期其他實(shí)驗(yàn)組的2倍；培養(yǎng)3d時(shí)，處理組D抱卵率達(dá)到最高值，在130%左右，是對(duì)照組A的3倍左右，其余處理組種群抱卵率也比對(duì)照組要高；培養(yǎng)4d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出都現(xiàn)了不同程度的種群抱卵率下降，但處理組D的抱卵率還是最高的。

2.3 乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)種群平均增長(zhǎng)率的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲(chóng)對(duì)其種群平均增長(zhǎng)率的影響變化見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，在種群起始密度均等的情況下，不同乳酸菌接入量的實(shí)驗(yàn)組其種群平均增長(zhǎng)率也不同，但整體呈上升趨勢(shì)。處理組D相比較其他實(shí)驗(yàn)組有明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，而處理組E隨著培養(yǎng)進(jìn)行到后期，其種群平均增長(zhǎng)率明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)1d時(shí)，處理組D與其他實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著（P＜0.05），且平均增長(zhǎng)率明顯高于其他組太多，接近60%，是處理組B、C、E平均的2.5倍，是對(duì)照組平均正常率的5倍；培養(yǎng)2d時(shí)，處理組與對(duì)照組之間差異顯著（P＜0.05），且處理組D與其他組之間也差異顯著（P＜0.05），平均增長(zhǎng)率達(dá)到80%，是對(duì)照組的2.5倍左右；培養(yǎng)3d時(shí)，處理組D平均增長(zhǎng)率趨近平緩，處理組E增長(zhǎng)出現(xiàn)緩慢，其平均增長(zhǎng)率小于其他對(duì)照組、遠(yuǎn)小于其他處理組；培養(yǎng)4d時(shí)，處理組平均增長(zhǎng)率無(wú)明顯增長(zhǎng)，趨近平緩。處理組D與其他實(shí)驗(yàn)組之間相互都差異顯著（P＜0.05），平均增長(zhǎng)率處于最高值在80%以上。

2.4 乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)培養(yǎng)水體pH值的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)培養(yǎng)水體pH的影響變化見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，由于乳酸菌為酸性物質(zhì)，其實(shí)添加量決定其起始pH，乳酸菌加入量多對(duì)應(yīng)其實(shí)驗(yàn)組pH更低，按pH從大到小依次是對(duì)照組A、處理組B、處理組C、處理組D、處理組E。培養(yǎng)4d后，所有實(shí)驗(yàn)組整體pH都出現(xiàn)了不同程度的升高。在1d培養(yǎng)后，對(duì)照組A出現(xiàn)小幅度的升高，其他實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)不同程度的升高，其中處理組E升高最多到8.0左右，處理組E從5.8升高到7.8。在之后的3d培養(yǎng)中，對(duì)照組A升高程度趨近平緩數(shù)值在10.0以上；處理組B和C升高程度相似均達(dá)到9.5以上；處理組D升高到9左右；處理組E一直在8.5以下。

2.5 乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)培養(yǎng)水體溶解氧的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻對(duì)輪蟲(chóng)培養(yǎng)水體溶解氧的影響變化見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組溶解氧均出現(xiàn)了下降，其中處理組E下降最快，最低值已經(jīng)低于5.0mg/L。在第1d培養(yǎng)后，除實(shí)驗(yàn)組E下降其他實(shí)驗(yàn)組均升高，溶解氧均在18mg/L以上。培養(yǎng)2d時(shí)，處理組B、C、D與對(duì)照組A和處理組E之間差異顯著（P＜0.05），處理組E已下降10mg/L以下。培養(yǎng)第3d和第4d，各實(shí)驗(yàn)組溶解氧均出現(xiàn)降低，處理組E下降最多，到第4d時(shí)下降到5.0mg/L以下，其他實(shí)驗(yàn)組均在10mg/L左右。

3 討論

目前在輪蟲(chóng)的高密度培養(yǎng)中，微藻類(lèi)作為主要生物餌料，其中小球藻是適合輪蟲(chóng)大規(guī)模培育的優(yōu)質(zhì)餌料，它雖含有輪蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的某些非必需氨基酸和脂肪酸^[8]，但因單一藻類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有限，不能更高效地生產(chǎn)輪蟲(chóng)，隨之微生態(tài)制劑與藻類(lèi)的搭配的研究也逐漸增多。該試驗(yàn)對(duì)微生態(tài)制劑乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲(chóng)進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，在小球藻作為主體餌料濃度一定的情況下，添加適量的乳酸菌可促進(jìn)褶皺臂尾輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)，而且效果顯著。

在輪蟲(chóng)種群培育階段，有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)對(duì)其種群增長(zhǎng)起到至關(guān)重要的作用^[9]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同接入量的乳酸菌和小球藻混合進(jìn)行投喂輪蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)處理組D在種群密度、抱卵率、平均增長(zhǎng)率上都優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組。由于處理組E添加了過(guò)量的乳酸菌，對(duì)種群培養(yǎng)產(chǎn)生了很大的不利影響，導(dǎo)致其從第2d培育時(shí)就比其他處理組和對(duì)照組在種群密度、抱卵率、平均增長(zhǎng)率明顯的下降，因此過(guò)量的乳酸菌量添加，不僅沒(méi)有幫助改善水體環(huán)境和輪蟲(chóng)生長(zhǎng)，反而抑制了輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)；而處理組B、C、D較對(duì)照組A都出現(xiàn)了明顯的種群密度增長(zhǎng)，隨著乳酸菌添加量的升高，其對(duì)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)起到的助力更多，其中處理組D是在同一培育時(shí)期對(duì)照組A的種群密度的3倍。分析其原因，乳酸菌本身通過(guò)繁殖可產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)、氨基酸和各類(lèi)維生素等營(yíng)養(yǎng)元素^[10]，而且部分代謝營(yíng)養(yǎng)元素已經(jīng)被證實(shí)可對(duì)輪蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生有益影響^[11]，王金秋等也證實(shí)了在酵母中添加了維生素C用其培養(yǎng)輪蟲(chóng)可顯著提高輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率^[12]。

輪蟲(chóng)培育不僅需要充足的營(yíng)養(yǎng)，還同樣也需要一個(gè)好的水體環(huán)境，才能更好地生長(zhǎng)。有研究證實(shí)褶皺臂尾輪蟲(chóng)培養(yǎng)的適宜pH值為5～9，但pH在8～9范圍內(nèi)增長(zhǎng)快^[13]。該次實(shí)驗(yàn)處理組D在培育期間pH變化范圍為8.0～9.5之間，pH都在一個(gè)適宜輪蟲(chóng)培育的區(qū)間，其抱卵量是同時(shí)期對(duì)照組的3倍，而其余實(shí)驗(yàn)組的pH都或高或低，對(duì)輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)效果都不如處理組D，可見(jiàn)適量的乳酸菌會(huì)提高輪蟲(chóng)的產(chǎn)量，利于其種群增長(zhǎng)。分析其原因，在正常的輪蟲(chóng)培育中，由于海水小球藻大量繁殖，通過(guò)光合作用吸收CO2，釋放O2氣，使得培育水體的pH偏高，顯堿性，有時(shí)pH都在10.2以上，這種情況很不利于輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)和抱卵，抑制其種群發(fā)展，而發(fā)酵好的乳酸菌制劑pH在3.0～4.0之間，顯酸性，通過(guò)酸堿中和，在小球藻中加入適量的乳酸菌制劑，使得輪蟲(chóng)培育水體pH在一個(gè)較適合輪蟲(chóng)培育的一個(gè)區(qū)間，故能使其種群增長(zhǎng)。同樣乳酸菌自身產(chǎn)生物質(zhì)可以降低水體中的亞硝酸鹽、氨氮和硫化氫濃度，還可以對(duì)水體生物殘留物、池底沉積的排泄物、殘餌等有機(jī)廢物進(jìn)行分解^[14]，為輪蟲(chóng)培育生長(zhǎng)提供一個(gè)良好的水環(huán)境。蓋建軍等也研究證實(shí)在亞硝酸鹽濃度較高的水產(chǎn)培育水體中使用芽孢桿菌制劑和乳酸菌制劑，能夠有效地降低亞硝酸鹽對(duì)水生動(dòng)物的危害^[15]。

對(duì)輪蟲(chóng)培育水體中溶解氧來(lái)說(shuō)，只要水體中不缺氧，對(duì)輪蟲(chóng)的培育不會(huì)影響。該實(shí)驗(yàn)中，處理組B、C、D在培育期間，水體溶解氧沒(méi)有明顯的下降，對(duì)其輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)影響較小，而處理組E加入了過(guò)量的乳酸菌，導(dǎo)致水體溶解氧直線(xiàn)下降，進(jìn)而導(dǎo)致其輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明只有適量的乳酸菌濃度才能對(duì)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。故在輪蟲(chóng)培育中在小球藻培養(yǎng)水體中添加適量的乳酸菌可以改善培養(yǎng)水體環(huán)境，促進(jìn)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)。

4 問(wèn)題與展望

輪蟲(chóng)種群生長(zhǎng)受餌料種類(lèi)和環(huán)境因子影響，其培育條件和餌料供應(yīng)已有大量研究，但利用微生態(tài)制劑乳酸菌加快輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)的報(bào)道較少。該試驗(yàn)證實(shí)了添加適量的乳酸菌能明顯增強(qiáng)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)，但是最適的添加比例以及乳酸菌促進(jìn)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)的協(xié)同作用機(jī)理等還需要進(jìn)一步研究。

該試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室理想狀態(tài)下進(jìn)行，乳酸菌受到其他菌株影響很小，如果在室外大面積水體高密度培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)水體易受周?chē)h(huán)境影響，導(dǎo)致水體中菌落生態(tài)較復(fù)雜，如何在大水體環(huán)境下確保濃度與活菌數(shù)是生產(chǎn)中的關(guān)鍵，這也是以后的研究方向。

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Effect of lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis

MA Qingbin， LIU Fang， LIANG Fang， XING Dongfei， SUN Na

（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）

Abstract：In order to study the effect of Lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis， the rotifers hatched from the rotifer pond of Panjin Guanghe Crab Industry Co.， Ltd.were used as the test object， and and C. vulgaris was used as the rotifer base bait with different concentrations of probiotics Lactic acid bacteria. The concentration gradients of Lactic acid bacteria were 0 cells/mL， 1×10⁸cells/mL， 2×10⁸cells/mL， 5×10⁸cells/mL and 10×10⁸cells/mL， the rotifer population density， egg-holding rate， average growth rate and so on were observed for 4 days and the data were counted. The results showed that when the population density of rotifers was the same， the maximum population density， egg-holding rate and average growth rate of rotifers in the group treated with appropriate concentrations of lactic acid bacteria were three times， three times and five times higher than those in the control group at the same period （P<0.05）， and the pH of the culture water was effectively reduced to a suitable range for rotifer growth. And with C. vulgaris as the rotifer base bait， the addition of certain concentration of lactic acid bacteria is beneficial to the growth and reproduction of B. plicatilis， which can increase the population size of rotifers and promote the population growth.

Keywords：lactic acid bacteria; Brachionus plicatilis; Chlorella vulgaris; population density; population growth