張瀅　彭濤　苗茜　劉笑笑　丁輝

摘 要：利用量子點（QDs）標記T-2抗體（QDs-Ab）作為信號探針，建立了一種量子點免疫層析檢測方法（QDICA），用于快速檢測谷物中的T-2毒素。結果表明，QDICA的檢測限為5 μg·L-1。整體檢測時間不超過10 min，方法特異性良好且具有一定的有效性。T-2-QDICA操作簡便快速，成本低，滿足谷物中T-2殘留量的快速檢測要求。

關鍵詞：T-2毒素；量子點；免疫層析試紙條；谷物；快速檢測

Detection of T-2 Toxin in Cereals with Quantum Dot Labeled Immunochromatographic Test Strip

ZHANG Ying， PENG Tao， MIAO Qian， LIU Xiaoxiao， DING Hui

（Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730050， China）

Abstract： A quantum dot immunochromatographic assays （QDICA） using quantum dot labeled T-2 antibody （QDs-Ab） as signal probe were developed for the determination of T-2 in cereals. The limit of detection for T-2 was 5 μg·L-1. The detection time was 10 min. The assays have good specificity and effectiveness. The QDICA is simple， fast， and low cost， it is suit for rapid detection of T-2 in cereals.

Keywords： T-2 toxin; quantum dot; immunochromatography test strip; cereal; rapid detection

單端孢霉烯族毒素是一大類化學結構相關的真菌毒素，根據(jù)其特征官能團的不同可分為A、B、C、D 4種類型。T-2是A類型中毒性最強的，廣泛分布在谷物及動物飼料中，性質(zhì)穩(wěn)定，不易滅活。T-2會引起急性和慢性毒性，對人和動物的多種組織和器官產(chǎn)生毒害作用，能夠引起的毒性效應包括消化系統(tǒng)和肝臟毒性、骨系統(tǒng)損傷、基因與細胞毒性、血液系統(tǒng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性、神經(jīng)毒性和生殖發(fā)育毒性等[1]。

隨著檢測技術的快速發(fā)展，目前國內(nèi)外對T-2的測定方法主要有液相色譜（Liquid Chromatography，LC）、液質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）、氣相色譜（Gas Chromatography，GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）及免疫法[2]。其中LC-MS不需要在檢測過程中對T-2進行復雜的衍生，故成為T-2最常用的分析檢測方法，但其費時費力，成本高。最便捷、靈敏度高的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法，可用于廣泛的糧食樣品T-2的篩查。基于ELISA衍生出的免疫層析法，成本低且適用于大量樣品的現(xiàn)場快速分析[3]，對減少T-2的污染和降低暴露風險有積極作用。

QDs是一種新型納米材料，制備簡單，發(fā)光效率高，化學穩(wěn)定性好。QDs憑借其諸多優(yōu)點及獨特的熒光效應，在食品中有毒有害小分子物質(zhì)的快速檢測領域得到廣泛應用[4-5]。本研究以量子點和T-2抗體為基礎，制備QDs-Ab熒光探針，建立一種T-2-QDICA新方法，以期能夠縮短谷物中T-2的檢測時間，降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品墊、結合墊、吸水紙墊、PVC板、Milipore HF 140s硝酸纖維素膜，上海金標公司；羧基化水溶性量子點，武漢珈源公司；T-2單克隆抗體（T-2-Ab）、T-2包被原（T-2-BSA）、T-2 ELISA試劑盒，山東綠都生物科技有限公司；T-2毒素（T-2）、黃曲霉毒素B₁（AFB₁）、黃曲霉毒素M₁（AFM₁）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬毒素B₁（FB₁）、嘔吐毒素（DON）、赭曲霉毒素A（OTA），德國Dr.Ehrenstorfer公司；羊抗鼠二抗（IgG）、乙基碳二亞胺（EDC），美國Sigma公司；玉米，當?shù)爻小?/p>

1.2 設備與儀器

HM3035噴金儀、ZQ2000自動斬切機，上海金標生物有限公司；ZF1-Ⅱ紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 QDs-Ab復合物的制備

取25 μL QDs（8 μmol·L^-1）于2.0 mL離心管中，加入93 μg EDC，再分別加入12 μg、24 μg、30 μg T-2-Ab，混合均勻，210 r·min^-1室溫下避光充分反應4 h。然后將溶液在4 ℃條件下12 000 r·min^-1離心3 min除團聚。然后用規(guī)格為100 kDa的超濾離心管將離心后的上清液濃縮，使用尺寸排阻柱對濃縮液純化，最終得到QDs-Ab復合物。

1.3.2 QDICA的組裝

將140s硝酸纖維素膜、吸水紙墊、結合墊和樣品墊依次粘貼在PVC板上，將羊抗鼠IgG、T-2-BSA分別包被在NC膜上，作為QDICA的質(zhì)控線（C線）、檢測線（T線），于37 ℃烘箱中放置4～6 h，用自動斬切機斬斷成寬為3.7 mm的試紙條，儲存在常溫、干燥、避光的條件下。

1.3.3 QDICA實驗條件優(yōu)化

樣品的上樣緩沖液、QDs-Ab復合物的添加量、工作液的加入量、二抗和T-2-BSA的稀釋倍數(shù)等都直接影響試紙條的準確性以及靈敏度。分別選擇QDs-Ab的添加量為0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為3 μL、5 μL、8 μL、10 μL以及4種不同的上樣緩沖液進行試紙條檢測，當試紙條C、T線熒光強度一致且適中、熒光條帶清晰以及背景干擾程度小時，確定為QDICA最佳工作條件。

1.3.4 QDICA方法檢測限確定

將T-2用上樣稀釋液依次稀釋為0 μg·L^-1、1.0 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、5.0 μg·L^-1、8.0 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、25.0 μg·L^-1，分別和一定量的QDs-Ab復合物、工作液在試紙條最優(yōu)工作條件下上樣，10 min后通過紫外分析儀觀察檢測結果。T線熒光條帶恰好完全消失時所對應的T-2最小濃度確定為T-2-QDICA的可視化檢測限。

1.3.5 QDICA方法特異性評價

在試紙條最佳工作條件下，分別檢測T-2、AFB1、FB1、ZEN、OTA、DON和AFM1，通過觀察C、T線顯色情況，進行方法特異性評價。

1.3.6 QDICA實際樣品的檢測及有效性驗證

選擇陰性谷物樣品作為實際樣品進行測定。準確稱取5 g粉碎均勻的谷物樣品，精密加入5 mL 75%的甲醇溶液作為樣品提取液充分提取，渦旋20 min后，離心機3 900 r·min^-1下離心10 min，留下上清液待用。將陰性樣品上清液用上樣緩沖液稀釋4倍來消除基質(zhì)影響，最后進行試紙條上樣檢測。

本實驗利用商品化ELISA試劑盒驗證QDICA方法的有效性。

2 結果與分析

2.1 制備QDs-Ab時QDs和T-2-Ab添加比例的優(yōu)化

QDs和T-2-Ab的添加比例會影響QDs-Ab復合物的偶聯(lián)效率，最終影響QDICA方法的靈敏度。本研究選擇摩爾比為1∶4、1∶8、1∶10的QDs和T-2-Ab制備QDs-Ab。由圖1可知，QDs和T-2-Ab摩爾比為1∶8時，熒光強度最強，所以選擇QDs和T-2-Ab摩爾添加比例為1∶8。

2.2 上樣緩沖液的優(yōu)化

試紙條的上樣緩沖液會影響免疫反應活性，緩沖液的pH值、溶液中不同離子的濃度均會影響C、T線的熒光強度。本研究選擇pH值為5.7和7.4的PB、pH值為7.4的PBS、pH值為8.3的BBS作為上樣緩沖液進行試紙條檢測。結果發(fā)現(xiàn)，緩沖液為pH=5.7的PB時，C、T線處熒光亮度差；緩沖液為pH=7.4的PB時，C、T線處熒光條帶均勻清晰，QDICA靈敏度較好；緩沖液為pH=7.4的PBS時，QDICA靈敏度稍差；緩沖液為pH=8.3的BBS時，C線處熒光條帶亮度稍弱，可能引起實驗結果無效的誤判。綜上，最終選擇pH=7.4的PB作為試紙條上樣緩沖液和樣品稀釋液。

2.3 QDs-Ab復合物和工作液添加量的確定

QDs-Ab復合物的加入量決定著QDICA C、T線處熒光強度，直接影響QDICA方法的靈敏度。工作液的加入主要影響樣品溶液在QDICA上的層析速度，進而影響QDs-Ab與T-2-BSA結合效率，間接影響了實驗結果的準確性。本文研究QDs-Ab的添加量為0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為3 μL、5 μL、8 μL、10 μL時，QDICA C、T線處的熒光強度。結果發(fā)現(xiàn)，當加入QDs-Ab復合物量較少（0.1 μL）時，C、T線熒光強度較弱，說明沒有足夠的QDs-Ab復合物與C、T線上二抗和T-2-BSA結合；當加入QDs-Ab復合物量太多（0.5 μL）時，導致C、T線熒光亮度太強而靈敏度降低。隨著工作液添加量的增加，變化梯度由一般到明顯再到一般。因此，本文最終確定QDs-Ab和工作液的加入量分別為0.3 μL和8.0 μL。

2.4 QDICA檢測限的確定

將配制成不同濃度的T-2混合樣品溶液滴加在樣品墊上，10 min后通過紫外分析儀觀察檢測結果。

如圖2所示，當樣品中不含T-2時，C、T線上熒光條帶清晰，亮度均勻一致。隨著T-2濃度逐漸升高，C線不變，T線的熒光強度逐漸變?nèi)踔敝料Р灰?。T-2濃度為5 μg·L^-1時，T線上熒光條帶恰好完全消失。經(jīng)過幾次重復實驗，確定T-2-QDICA方法的可視化檢測限為5 μg·L^-1。

2.5 T-2-QDICA特異性的評價

如圖3所示，5 μg·L^-1的T-2就能夠使QDICA T線處的熒光條帶消失，而其余6種高濃度真菌毒素標準品溶液（濃度均為1 mg·L-1）都不能與T線處包被物結合，從而使T線熒光條帶消失。說明QDs-Ab復合物只能和其對應的T-2抗原結合，與其他6種常見的真菌毒素均無交叉，特異性好。

2.6 T-2-QDICA有效性的驗證

經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn)，實驗中QDICA方法與ELISA試劑盒的檢測結果一致，證明QDICA方法高效、有效，可簡單、快速實現(xiàn)T-2在谷物中的半定量檢測。

3 結論

本研究利用QDs作為熒光標記物，基于免疫特異性識別，建立了一種靈敏、快速的熒光免疫層析方法用于檢測谷物中T-2的殘留量。本方法相較于大型儀器檢驗方法，檢測時間短，操作簡單，實際樣品中測定結果與ELISA試劑盒測定結果一致，證明本方法有效且具有一定實用性。

參考文獻

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