孫銘澤, 尹 玲

(濟寧學(xué)院化學(xué)化工與材料學(xué)院,山東 曲阜 273155)

0 引 言

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用,因此被大量應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞早期檢測和治療研究中[1-3]。Fe3O4納米顆粒因其尺寸小、比表面積大、超順磁性和毒性小等特點,已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和材料科學(xué)等多個研究領(lǐng)域[4-9]。聚乙二醇(PEG)可以增加極性官能團(tuán)的密度,使修飾后的磁性納米顆粒具有很好的水溶性和穩(wěn)定性,成為金屬納米粒子常用的表面修飾劑[10-11]。當(dāng)金屬納米顆粒與熒光分子連接時,會使熒光分子出現(xiàn)明顯的熒光淬滅現(xiàn)象。近年來大量文獻(xiàn)報道,“點亮型”熒光納米探針被廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感、生物檢測和醫(yī)學(xué)成像等研究領(lǐng)域[12-13]。首先合成Fe3O4納米顆粒,并在其表面修飾PEG,再與異硫氰酸熒光素(FITC)修飾的MMP-2特異性識別的多肽底物KCPLGVR偶聯(lián),成功制備得到一種新型MMP-2特異性響應(yīng)納米分子探針Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC,研究了其體外對MMP-2蛋白酶的檢測靈敏度和特異性,并進(jìn)行了過表達(dá)MMP-2的MCF-7細(xì)胞成像研究。實驗結(jié)果表明,該探針在MMP-2過表達(dá)的腫瘤早期診斷方面具有一定的應(yīng)用潛力。

1 實驗部分

1.1 KCPLGVR-FITC的合成、純化和表征

如圖1,將三乙胺(TEA,9.8 mg,0.096 mmol)和疊氮丙胺(9.6 mg,0.096 mmol)分別滴加到溶有異硫氰酸熒光素(FITC-NCS,28 mg,0.072 mmol)的1 mL DMF溶液中,在室溫下避光攪拌反應(yīng)。高效液相色譜(HPLC)跟蹤到反應(yīng)結(jié)束,脫掉溶劑濃縮后,粗樣品再用柱層析分離純化,最后得到疊氮異硫氰酸熒光素(FITC-N3,黃色粉末)。

在抗壞血酸鈉(4.8 mg,0.024 mmol)和無水硫酸銅(CuSO4,1.92 mg,0.012 mmol)催化作用下,使KCPLGVR(21.8 mg,0.024 mmol)和FITC-N3(14.6 mg,0.030 mmol)發(fā)生“點擊”反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化得到KCPLGVR-FITC,最后通過質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)(淡黃色固體)。MALDI-TOF-MS,C64H89N18O14S2[M+H]+,實驗值(計算值)m/z:1397.366(1397.625)。

1.2 Fe3O4納米顆粒的合成與表征

Fe3O4納米顆粒按照文獻(xiàn)方法制備[14]。在氮氣保護(hù)下,分別將FeCl3(3.88 g,0.0239 mol)及FeSO4·7H2O(3.34 g,0.012 mol)固體加到280 mL超純水中,使用攪拌器機械攪拌約1h,待固體充分溶解后,再往上述溶液中滴加68 mLNaOH水溶液(1.59 mol/L),直到溶液pH ≈ 9為止,隨著反應(yīng)進(jìn)行會有大量黑色沉淀出現(xiàn),繼續(xù)攪拌3h使沉淀更加完全。用磁鐵分離,依次用超純水、無水乙醇洗滌,直至沉淀呈中性,最后放入真空干燥箱,在70℃條件下真空干燥,得到Fe3O4顆粒,標(biāo)定好濃度備用。

圖1 KCPLGVR-FITC的合成路線

1.3 Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的制備

Fe3O4納米顆粒(160 μg·mL-1,1.0 mL)溶液中加入dp-PEG-Mal(MW = 2K,5 mg,0.5 mL),超聲15min后,室溫下避光攪拌8h。反應(yīng)結(jié)束后,15000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min兩次洗滌純化,記為Fe3O4-PEG-Mal。往上述Fe3O4-PEG-Mal(160μg·mL-1,1.0 mL)的TBS(pH = 7.2)溶液中加入溶有KCPLGVR-FITC(50 mg·mL-1,0.02 mL)的二甲亞砜溶液。在室溫避光攪拌反應(yīng)1h后,將溶液離心15min(15000轉(zhuǎn)/分鐘),然后用超純水洗滌3次,洗完后還要用超純水再分散,標(biāo)好濃度備用。通過檢測水合粒徑、Zeta電位、紫外吸收光譜和透射電鏡(TEM)對反應(yīng)前后Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC性質(zhì)和形貌進(jìn)行表征。

1.4 探針對MMP-2靈敏度和特異性的體外測試

探針Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)在37℃與不同濃度的MMP-2(0,10,20,40,80,160,320,640 ng·mL-1)TBS溶液(pH = 7.2)孵育2h后,利用熒光光譜儀檢測不同溶液中熒光信號的變化。在有無MMP-2抑制劑GM6001(0.1 mg·mL-1)存在的條件下,Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)和MMP-2(320 ng·mL-1)在37℃時分別孵育2h,然后用熒光光譜儀測定對應(yīng)溶液的熒光強度。

1.5 細(xì)胞熒光成像

小鼠成纖維細(xì)胞3T3和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7分別與50 μg·mL-1探針于5% CO2,37℃下孵育8h。同時在孵育后的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提前加入0.1 mg·mL-1MMP-2抑制劑GM6001開展競爭實驗研究,最后通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光成像情況。

圖2 (a)KCPLGVR-FITC的HPLC圖譜;

(b)KCPLGVR-FITC,Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-

PEG-KCPLGVR-FITC的紫外吸收圖譜;

(c) Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-

FITC的TEM照片

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的設(shè)計、合成與表征

首先,根據(jù)合成路線制得FITC-N3,由核磁氫譜、碳譜和高分辨質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)構(gòu)(見附圖1、2、3)。然后再與KCPLGVR多肽底物中的末端炔通過發(fā)生“點擊”反應(yīng)得到KCPLGVR-FITC,產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)由HPLC圖譜和質(zhì)譜確證(如圖2a和附圖4)。然后將dp-PEG-Mal(MW = 2K)修飾于Fe3O4納米顆粒表面,相應(yīng)的溶液Zeta電位變?yōu)?.9 ± 0.8 mV。最后,KCPLGVR-FITC末端的巰基與納米顆粒表面的馬來酰亞胺發(fā)生反應(yīng),Zeta電位升至15.8 ± 0.2 mV,表明KCPLGVR-FITC被成功地連接到Fe3O4納米顆粒表面。如圖2b紫外可見吸收光譜顯示,修飾了PEG后的Fe3O4納米顆粒在490 nm處沒有明顯的紫外吸收。但是連接了KCPLGVR-FITC之后的探針Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC在490 nm處表現(xiàn)出一定的紫外吸收。

表1和圖3數(shù)據(jù)顯示,PEG修飾的Fe3O4納米顆粒以及探針Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的水合粒徑差別不大,都約為45 nm,且TEM結(jié)果顯示(如圖2c),納米顆粒大小均一,分散性較好,尺寸大小變化較小。

表1 Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC的水合粒徑和Zeta電位

圖3 Fe3O4-PEG-Mal和Fe3O4-PEG-KCPLGVR-

FITC的水合粒徑(a)和Zeta電位(b)

2.2 體外實驗研究探針對MMP-2的靈敏度和特異性

通過圖4a發(fā)現(xiàn),相同濃度的Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC(100 μg·mL-1)熒光強度會隨著MMP-2用量的增加而增強,當(dāng)MMP-2用量達(dá)到一定濃度(320 ng·mL-1)后,熒光強度就不再有明顯增強,表明此時探針已大部分和MMP-2反應(yīng),對MMP-2具有較強的檢測靈敏度。如圖4b所示,探針與MMP-2反應(yīng)后的溶液在518 nm處的熒光強度比探針自身背景增強了21倍,而提前加了抑制劑的另一份溶液反應(yīng)后的熒光強度僅增加5倍,說明該探針對MMP-2具有一定的特異性。

2.3 細(xì)胞熒光成像

小鼠成纖維細(xì)胞3T3和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7分別與探針孵育8h后,通過激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像。通過圖5發(fā)現(xiàn),探針與MCF-7細(xì)胞孵育后,檢測到細(xì)胞內(nèi)有較強的綠色熒光信號;加了抑制劑后再孵育,細(xì)胞內(nèi)的熒光信號被明顯抑制;而探針與3T3細(xì)胞孵育后僅表現(xiàn)出微弱的熒光信號,以上結(jié)果說明探針可以用于MMP-2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞熒光成像。

圖4 (a)相同探針與不同濃度MMP-2反應(yīng)后的熒光光譜;

(b)探針、探針+ MMP-2以及探針+MMP-2

+抑制劑反應(yīng)后的熒光光譜。 [探針] = 100 μg·mL-1,

[MMP-2] = 320 ng·mL-1,[抑制劑] = 0.1 mg·mL-1

圖5 細(xì)胞成像研究:3T3+探針;MCF-7+探針;

MCF-7+抑制劑+探針。[探針] = 50 μg·mL-1,

[抑制劑] = 0.1 mg·mL-1,比例尺 = 60 μm

3 結(jié) 語

將表面修飾PEG的Fe3O4納米顆粒與連接熒光染料FITC的多肽底物KCPLGVR反應(yīng),設(shè)計合成出一種MMP-2特異響應(yīng)型熒光納米探針Fe3O4-PEG-KCPLGVR-FITC。體外實驗表明,該探針對MMP-2呈現(xiàn)出較高的靈敏度和特異性,并且可用于MMP-2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞熒光成像,為MMP-2過表達(dá)腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供了重要的依據(jù)。