王新 王天香 耿艷華 施佳 梁木鳳 周美玲 吳千葉

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核之一，而脊柱是骨關(guān)節(jié)結(jié)核最常見的發(fā)病部位之一，其發(fā)病率占骨關(guān)節(jié)結(jié)核的40%～50%［1］。脊柱結(jié)核是較嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)疾病，治療不及時(shí)可導(dǎo)致椎體嚴(yán)重破壞、脊柱畸形和神經(jīng)損害。近年來新興的有關(guān)程序性細(xì)胞死亡配體-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）和淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的免疫治療日益受到關(guān)注，并在腫瘤治療領(lǐng)域取得了不錯(cuò)的成果，然而在應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的時(shí)候常會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病或結(jié)核復(fù)燃的情況［2］。因此，探索PD-L1、LAG-3 在骨結(jié)核中的表達(dá)對(duì)骨壞死和炎性浸潤(rùn)等疾病進(jìn)展情況的影響，可加深對(duì)疾病的變化和發(fā)展的認(rèn)識(shí)。LAG-3 也是重要的免疫抑制性受體，能負(fù)向調(diào)節(jié)活化的T 細(xì)胞的增殖和功能［3］。本研究通過分析PD-L1 和LAG-3 免疫組化的表達(dá)情況及對(duì)脊柱結(jié)核特有的病理形態(tài)變化的影響，并探索其臨床病理相關(guān)性，以期更深入了解其在骨結(jié)核中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本及臨床資料 選取自2021 年6 月至2022年9 月于杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院就診的50 例脊柱結(jié)核患者的石蠟標(biāo)本設(shè)為觀察組，11 例非結(jié)核炎癥性脊柱標(biāo)本設(shè)為對(duì)照組。所選標(biāo)本患者均無免疫系統(tǒng)相關(guān)嚴(yán)重疾病，無人免疫缺陷性病毒陽(yáng)性，近期無應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑。61 例標(biāo)本中男45 例，女16 例；年齡18～58 歲，平均（54.6±1.4）歲，中位數(shù)年齡54.0 歲；其中≥50歲患者40 例，＜50 歲21 例；所有病例均通過病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)、相關(guān)免疫學(xué)檢測(cè)及病理學(xué)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)確診。

1.2 儀器和試劑 濃縮型兔抗人LAG-3 抗體（克隆號(hào)：EPR20261）采購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；濃縮型兔抗人PD-L1 抗體（克隆號(hào)E1L3N）采購(gòu)自廈門艾德生物公司；常規(guī)染色試劑盒、免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒均采購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡采購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3 免疫組化（IHC）采用SP 法二抗試劑盒進(jìn)行孵育，DAB 顯色，蘇木精襯染細(xì)胞核，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，胞漿和胞膜染色成黃色，含有粗細(xì)不一的棕黃色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。使用奧林巴斯BX41 顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)采集圖像，所有切片分析在同一強(qiáng)度、同一放大倍數(shù)下進(jìn)行。采用image J 圖像分析軟件［4］（1.8.0，NIMH）對(duì)免疫組化的表達(dá)進(jìn)行平均光密度值分析測(cè)量。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊的高倍鏡視野（×400），計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。根據(jù)雙變量是否符合正態(tài)性分布采用Pearson 或Spearman 相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊柱結(jié)核組織不同標(biāo)本中的HE 及抗酸染色情況 見圖1。

圖1 HE及抗酸染色。A.骨小梁間可見典型結(jié)核肉芽腫（HE，×200）；B.伴有復(fù)雜炎性背景的脊柱結(jié)核（HE，×200）；C.脊柱結(jié)核標(biāo)本可見抗酸染色陽(yáng)性（抗酸染色，×200）

2.2 PD-L1 和LAG-3 在脊柱結(jié)核組織不同區(qū)域中的表達(dá)情況 PD-L1 陽(yáng)性主要位于結(jié)核病灶中的類上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞，胞膜及胞質(zhì)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。LAG-3 陽(yáng)性主要位于結(jié)核結(jié)節(jié)周邊淋巴細(xì)胞及分葉核粒細(xì)胞。PD-L1 和LAG-3 免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果見圖2。PD-L1 在脊柱結(jié)核組織中的平均光密度值為（10.6×104±8.2×104）高于對(duì)照組（1,315.8±1,605.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LAG-3 在觀察組的平均光密度值為（2.7×103±2.5×103）低 于對(duì)照 組（7.2×103±13.7×103），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0657＞0.05），見圖3。

圖2 PD-L1和LAG-3在脊柱結(jié)核病灶組織中的表達(dá)情況。A.PD-L1在脊柱結(jié)核組織中的表達(dá)（SP，×400）；B.LAG-3在脊柱結(jié)核組織中的表達(dá)（SP，×400）

圖3 觀察組和對(duì)照組中PD-L1和LAG-3表達(dá)的比較（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.3 PD-L1 和LAG-3 的表達(dá)與脊柱結(jié)核臨床病理特征及其他變量的關(guān)系 PD-L1 在病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)有典型結(jié)核肉芽腫的病例中高表達(dá)，在具有復(fù)雜的炎癥性背景為主的病例中低表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與抗酸染色、年齡、性別等無關(guān)（P＞0.05）；LAG-3 表達(dá)與脊柱結(jié)核患者標(biāo)本中病理形態(tài)學(xué)類型、抗酸染色、年齡和性別等均無關(guān)（P＞0.05）。

2.4 PD-L1 和LAG-3 在脊柱結(jié)核組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 椎體骨結(jié)核標(biāo)本中PD-L1 和LAG-3 平均光密度值相關(guān)性分析顯示，PD-L1 與LAG-3 呈中度負(fù)相關(guān)性（r=-0.4，P＜0.05）（圖4）。

圖4 LAG-3與PD-L1的相關(guān)性

3 討論

脊柱結(jié)核約占骨關(guān)節(jié)結(jié)核的半數(shù)以上，若治療不及時(shí)，椎體及椎間盤受累加重，可導(dǎo)致脊柱塌陷、結(jié)核累及椎管引起截癱或其他嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［6］。

PD-L1 與PD-1 結(jié)合后，可激活一系列信號(hào)通路，抑制免疫細(xì)胞的過度激活，從而減少免疫細(xì)胞分泌抗體和細(xì)胞因子，是人體避免過度免疫自我保護(hù)的機(jī)制。而腫瘤細(xì)胞可以自我生成PD-L1，甚至耗盡免疫細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸［7］。LAG-3 是重要的免疫抑制性受體能夠抑制T 細(xì)胞增殖，負(fù)向調(diào)節(jié)活化的T 細(xì)胞的增殖和功能。較強(qiáng)的T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)誘導(dǎo)較高LAG-3 的表達(dá)，表明LAG-3 的誘導(dǎo)可能充當(dāng)負(fù)反饋以防止免疫反應(yīng)的過度激活［3］。

本資料顯示在脊柱結(jié)核中LAG-3 表達(dá)主要局限于結(jié)核結(jié)節(jié)周圍的中性分葉核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞；PD-L1 表達(dá)主要位于結(jié)核結(jié)節(jié)的類上皮細(xì)胞。且PD-L1 的表達(dá)情況明顯高于LAG-3。在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)PD-L1 與LAG-3 呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.402，P＜0.05）。本研究顯示，形態(tài)學(xué)上部分病例是以骨小梁間典型的肉芽腫結(jié)節(jié)或少量不典型上皮樣組織細(xì)胞結(jié)節(jié)反應(yīng)伴凝固性壞死，而其他類型炎癥細(xì)胞相對(duì)少見。其余病例則是以非典型的結(jié)核形態(tài)學(xué)，即以明顯復(fù)雜的炎癥性背景伴以散在無規(guī)律單核巨噬細(xì)胞增生，偶可伴有少量不典型肉芽腫。而研究還顯示了病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為明顯復(fù)雜的炎癥性病例組中背景除單核巨噬細(xì)胞增生外可伴有少量不典型肉芽腫，但PD-L1 均值較病理形態(tài)學(xué)為典型結(jié)核肉芽腫脊柱結(jié)核標(biāo)本組低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-2.806，P＜0.05）。這與相關(guān)報(bào)道的結(jié)果是一致，該報(bào)道認(rèn)為脊柱結(jié)核的典型病理表現(xiàn)是結(jié)核肉芽腫性炎，人體主要是通過肉芽腫將結(jié)核桿菌與受累組織分隔開而限制了感染的播散，但是這種隔絕又會(huì)限制機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除［8］。有研究表明，在感染及腫瘤病例中PD-1/PD-L1 組成的通路可導(dǎo)致T 細(xì)胞功能耗竭［9］。李奇鳳等［10］的研究表明結(jié)核病兒童外周血中PD-1/PD-L1 基因表達(dá)水平明顯高于健康兒童。這與食蟹猴結(jié)核病模型報(bào)道的結(jié)果是類似的，該模型的報(bào)道顯示表達(dá)LAG-3或PD-1的大多數(shù)T細(xì)胞并未發(fā)生免疫功能的衰竭［11］。表明在脊柱結(jié)核結(jié)節(jié)中PD-L1 的高表達(dá)可能存在獨(dú)立于局部活化的T 細(xì)胞的PD-1/PD-L1 信號(hào)通路，并可能是發(fā)揮下調(diào)免疫功能的主要通路。有文獻(xiàn)顯示TGF-β 可以在結(jié)核中高表達(dá)［12］，并通過smad2/3或者nonsmad2/3（PI3K/Akt/TOR）通路調(diào)控PD-L1 的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞的免疫受到抑制［13］，這與脊柱結(jié)核由復(fù)雜炎癥反應(yīng)階段進(jìn)展至T 細(xì)胞免疫耗竭后形態(tài)上表現(xiàn)出較多肉芽腫并發(fā)生多量干酪樣壞死，且不易局限的結(jié)果是一致的。

本資料結(jié)果顯示，相關(guān)抗體PD-L1 在典型脊柱結(jié)核中表達(dá)較明顯，推測(cè)這可能與免疫反應(yīng)中TGF-β 調(diào)控PD-L1 表達(dá)上調(diào)相關(guān)通路的啟動(dòng)有關(guān)［14］。而具有典型結(jié)合表現(xiàn)的病灶中T細(xì)胞表達(dá)的LAG-3顯著減少，與最終導(dǎo)致的T 淋巴細(xì)胞免疫受到抑制的表現(xiàn)一致［9］。骨結(jié)核病理表現(xiàn)以骨小梁間混合性炎性增生為主的病例，雖在形態(tài)學(xué)上并不一定能夠出現(xiàn)多量、典型的肉芽腫和凝固性壞死，常以增生的單核組織細(xì)胞為特征伴有較為復(fù)雜的炎癥性背景，此時(shí)從形態(tài)上結(jié)核病的特征性表現(xiàn)并不十分典型，形態(tài)上常需要考慮排除是否合并有其他感染，但此類病變卻相對(duì)容易出現(xiàn)結(jié)核抗酸染色陽(yáng)性，本研究中的抗酸桿菌陽(yáng)性病例，均出現(xiàn)在了這些病例中。這類病變中，除存在較明顯的單核組織細(xì)胞PD-L1表達(dá)外，LAG-3 也均陽(yáng)性表達(dá)在其他炎癥性背景細(xì)胞中，此時(shí)的炎癥性反應(yīng)較為明顯，除有增生的單核組織細(xì)胞外，還有一定數(shù)量的淋巴細(xì)胞，少量中性粒、漿細(xì)胞參與，也可以見到血管和少量的纖維母細(xì)胞等炎癥反應(yīng)背景，此時(shí)并未較大范圍形成壞死，組織中的凝固性壞死并不突出、易見。這也與凝固性壞死未大范圍形成之前，T 細(xì)胞免疫功能及T 數(shù)量未完全耗竭的表現(xiàn)是一致的［11］，此時(shí)臨床上可以出現(xiàn)較明顯的結(jié)核中毒癥狀及局部疼痛表現(xiàn)。此時(shí)，如果機(jī)體的抵抗力足夠頑強(qiáng)、有效，或者能夠及時(shí)確診和得到有效藥物治療干預(yù)，病變或許是能夠獲得有效控制的。但因脊柱結(jié)核病灶以骨小梁間血管間質(zhì)受累在先，在免疫抑制發(fā)生后，病變進(jìn)展，繼而導(dǎo)致組織進(jìn)一步壞死，但骨小梁間空間狹小、間質(zhì)少，免疫反應(yīng)亦不能有效抑制致病菌，導(dǎo)致骨小梁發(fā)生溶蝕破壞，并進(jìn)一步沿著小梁間隙蔓延，病變難以局限形成類似于肺結(jié)核結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)結(jié)核結(jié)節(jié)局限性纖維化、鈣化包裹結(jié)節(jié)，直至病變侵襲周圍軟組織，形成結(jié)核冷膿腫病變不能有效局限于骨內(nèi)的情況，這也許正是脊柱結(jié)核難以形成類似于肺結(jié)核結(jié)節(jié)和淋巴結(jié)結(jié)核后期纖維化、鈣化、包裹結(jié)節(jié)等自限性改變的情況，隨著病情的進(jìn)展，而終須行外科病灶清除治療的原因。

上述結(jié)論也許能為脊柱結(jié)核病在發(fā)展的早中期階段能及時(shí)確診并進(jìn)行相關(guān)免疫治療干預(yù)和相關(guān)靶向治療，在病變尚未形成不可逆轉(zhuǎn)的組織損害前有效阻止病變的進(jìn)展提供有益的參考。