郝丹鳳 陳堅(jiān) 張梓祺 董學(xué)妍 林源吉 余道軍

鼻病毒（Human Rhinovirus，HRV）屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，是一組單正鏈的小分子RNA 病毒。HRV 的主要傳染源是患者及病毒攜帶者，經(jīng)過呼吸道傳播，可通過手到鼻或飛沫直接傳播。主要發(fā)生在早春和氣溫突然下降時節(jié)，尤其在人群擁擠及空氣不流通的地方易傳播［1-2］。在呼吸道疾病中HRV 感染可以和其他病毒、細(xì)菌一起引發(fā)雙重感染、多重感染或者混合感染［3-4］。HRV 的實(shí)驗(yàn)室檢測方法與其他呼吸道病毒類似，包括病毒的分離培養(yǎng)與鑒定、核酸測序法、免疫學(xué)檢測以及基于PCR 技術(shù)的病毒核酸檢測［5-6］。隨著對HRV 致病性認(rèn)識的加深和實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的發(fā)展，基于熒光定量PCR 技術(shù)的HRV 分子診斷試劑的研發(fā)受到重視。本研究選取鼻咽拭子標(biāo)本作為觀察對象，分別采用病毒分離培養(yǎng)、核酸測序以及熒光定量PCR 方法檢測HRV，對比分析三種方法的檢測性能，為基于熒光定量PCR 方法檢測HRV 分子診斷試劑研發(fā)提供臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材 HRV 核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：ZC2021003）；檢測設(shè)備：實(shí)時熒光定量PCR 儀（型號：7500；注冊證號：國械注進(jìn)20163220767）；核酸提取試劑：核酸提取或純化試劑（備案號：粵穗械備20170583 號；批號：2021059）；Hela 細(xì)胞（ATCC CCL-2），EMEM 培養(yǎng)基（ATCC 30-2002），胎牛血清（Gibco 10099141C）；測序法所用儀器為ABI 3730 測序儀（Thermo Fisher ABI 3730XL）。

1.2 一般資料（1）入選依據(jù)：本次臨床試驗(yàn)主要選取臨床確診或疑似為HRV 感染的病例，如呼吸道感染，包括肺炎、支氣管炎等患者（表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕及鼻塞、咳嗽、喘息、氣促等局部呼吸道癥狀）。同時，為考查HRV 核酸檢測試劑盒的臨床特異性，本次臨床試驗(yàn)還將納入部分臨床癥狀與HRV 感染相似，且臨床診斷為其它細(xì)菌或病毒感染（如呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人類冠狀病毒229E 型、人類冠狀病毒OC43 型、人類冠狀病毒NL63 型、人類冠狀病毒HKU1 型、肺炎衣原體、肺炎支原體、SARS 病毒、腸道病毒等）的病例。（2）入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床疑似為HRV感染的病例，如呼吸道感染病例，包括肺炎、支氣管炎等；②臨床癥狀與HRV 感染相似，且臨床診斷為其它細(xì)菌或病毒感染的病例；③取樣后封裝保存的鼻咽拭子或≥1mL 的樣本保存液；④性別、年齡不限。（3）排除標(biāo)準(zhǔn)：①樣本量不足以檢測者；②不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者。（4）剔除標(biāo)準(zhǔn)：①登記表記錄核心信息不完整的病例；②樣本因收集或保存不當(dāng)不能用于檢測者或檢測失敗者。

1.3 標(biāo)本采集方法 本次臨床試驗(yàn)中所使用的樣本均為人鼻咽拭子樣本。樣本采集方法為使用棉拭子輕柔轉(zhuǎn)動、緩慢插入受試者鼻孔至顎部，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出，將鼻咽拭子置入無菌采樣管，共采集2 根拭子。核酸提取前，加滅菌生理鹽水1.5 mL 至無菌采樣管，1根拭子放入生理鹽水管用于熒光探針法，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，立即離心或置4℃冰箱過夜；另1 根拭子放入病毒保存管中（內(nèi)含3 mL 病毒保存液），用于病毒分離培養(yǎng)。所采集的標(biāo)本可立即用于測試，或長期保存于（-70±5）℃，也可以保存于（-20±5）℃待測，保存期為6 個月，標(biāo)本避免反復(fù)凍融。以上鼻咽拭子樣本采集已獲得倫理委員會批準(zhǔn)豁免簽訂受試者知情同意書。

1.4 試驗(yàn)方法（1）PCR-熒光探針法（熒光定量PCR 法）：編盲樣本按照說明書及樣本操作規(guī)程進(jìn)行預(yù)處理即核酸提取，可馬上進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，或保存于（-20±5）℃待用（7 d 內(nèi)使用）。提取后的樣本按照HRV 核酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測，若檢測結(jié)果不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則按說明書要求進(jìn)行復(fù)檢，若復(fù)檢仍不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則剔除該樣本；若結(jié)果符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為結(jié)果可信。（2）病毒分離培養(yǎng)鑒定：按照病毒分離培養(yǎng)鑒定操作規(guī)程進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。若檢測結(jié)果不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則進(jìn)行復(fù)檢，若復(fù)檢仍不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則剔除該樣本；若結(jié)果符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為結(jié)果可信。（3）測序法：按照病毒核酸測序法（Sanger 測序方法）進(jìn)行操作。若檢測結(jié)果不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則進(jìn)行復(fù)檢，若復(fù)檢仍不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則剔除該樣本；若結(jié)果符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為結(jié)果可信。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析選用符合方案數(shù)據(jù)，即所有符合試驗(yàn)方案要求的受試者樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要采用四格表整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)?？己嗽噭┖秃怂釡y序法對比采用Kappa 一致性檢驗(yàn)，P≤0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)真實(shí)性評價：陽性符合率、陰性符合率、總符合率、Kappa 值等指標(biāo)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 樣本入組情況 本次試驗(yàn)共隨機(jī)篩選鼻咽拭子樣本220 例，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)，最終入組樣本220 例，均為新鮮樣本。樣本年齡范圍為7 d～87 歲（見表1），其中男103 例（占比46.82%），女117 例（占比53.18%）。本研究主要依據(jù)臨床背景信息選取疑似為HRV 感染的病例，同時還納入了少量易混淆的其它病原體感染病例對PCR-熒光探針法的檢測性能進(jìn)行驗(yàn)證。上述入組樣本的臨床背景信息主要包括：發(fā)熱130例，肺炎13 例，喘息性支氣管肺炎6 例，支氣管肺炎23 例，吸入性肺炎1 例，肺部感染4 例，支氣管炎7例，急性毛細(xì)支氣管炎4 例，急性支氣管炎2 例，哮喘性支氣管炎3 例，呼吸道感染2 例，急性上呼吸道感染11 例，急性扁桃體炎6 例，急性化膿性扁桃體炎3 例，急性喉氣管炎2 例，支氣管擴(kuò)張伴感染1 例，支氣管哮喘1 例，咳嗽1 例及其它相關(guān)癥狀，部分樣本存在多病癥交叉情況。

表1 年齡占比分層圖

2.2 三種方法HRV 檢出率 本次試驗(yàn)共檢測鼻咽拭子樣本220 例，病毒分離培養(yǎng)檢測陽性樣本為20 例、陰性樣本為200 例；核酸測序法檢測陽性樣本為32 例、陰性樣本為188 例；PCR-熒光探針法試劑檢測結(jié)果為陽性的樣本為35 例、陰性樣本為185 例。

2.3 PCR-熒光探針法與病毒分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果分析 根據(jù)病毒分離培養(yǎng)檢測結(jié)果，將220 例鼻咽拭子樣本研究對象分為陽性組和陰性組，將PCR-熒光探針法檢測結(jié)果與其進(jìn)行比較評價（見表2），兩者檢測陰陽性結(jié)果不一致樣本15 例。使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行kappa檢 驗(yàn)，kappa=0.692（95%CI：0.549～0.835），P＜0.001。α=0.05 檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，PCR-熒光探針法與病毒分離培養(yǎng)檢測結(jié)果的一致性一般。

表2 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)四格表（n）

2.4 PCR-熒光探針法與測序結(jié)果分析 根據(jù)核酸測序法檢測結(jié)果，將220 例鼻咽拭子樣本研究對象分為陽性組和陰性組，將PCR-熒光探針法檢測結(jié)果與其進(jìn)行比較評價（見表3），兩者檢測陰陽性結(jié)果不一致樣本3例。使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行kappa 檢驗(yàn)，kappa=0.947（95%CI 0.888～1.006），P＜0.001。α=0.05 檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，PCR-熒光探針法與核酸測序法檢測結(jié)果的一致性好。

表3 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)四格表（n）

3 討論

隨著臨床上對HRV 致病性、傳染性及流行病學(xué)研究的深入，HRV 實(shí)驗(yàn)室檢測也隨之得到重視。本次臨床試驗(yàn)采用病毒分離培養(yǎng)鑒定方法作為第一種實(shí)驗(yàn)室檢測方法，采用測序法作為第二種HRV 核酸檢測方法，將PCR-熒光探針法檢測結(jié)果分別與兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，用以評價PCR-熒光探針法的臨床應(yīng)用性能。

本次臨床試驗(yàn)隨機(jī)篩選樣本220 例，樣本類型均為鼻咽拭子，均為新鮮樣本。其中病毒分離培養(yǎng)和PCR-熒光探針法陰陽性檢測結(jié)果不一致的樣本15 例，核酸測序法2 和PCR-熒光探針法陰陽性檢測結(jié)果不一致的樣本為3 例，PCR-熒光探針法與核酸測序法2 檢測結(jié)果一致性較好（kappa=0.947，P＜0.001）。

在PCR 法用于病毒檢測前，病毒分離培養(yǎng)是作為病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，病毒的分離與鑒定對監(jiān)測流行病的新動向、研究新疾病、新病毒以及疫苗的研發(fā)都有重要作用。病毒分離法是一種傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可靠，缺點(diǎn)是操作繁瑣，部分標(biāo)本中病毒量少或活性低，產(chǎn)生細(xì)胞病變慢，常需盲傳2～3 代，若作病毒型別鑒定，實(shí)驗(yàn)周期更長，現(xiàn)已較少用于臨床［7］。對病毒分離培養(yǎng)和PCR-熒光探針法15 例檢測結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行分析，可能是樣本HRV 載量較低，未達(dá)到能使細(xì)胞出現(xiàn)CPE 病變的最低濃度，而PCR-熒光探針法的檢測靈敏度較病毒分離培養(yǎng)鑒定方法靈敏度高，從而導(dǎo)致PCR-熒光探針法檢測結(jié)果陽性而病毒分離培養(yǎng)檢測結(jié)果陰性。

Sanger 測序法采用的是直接測序法，是一代測序法的經(jīng)典代表，發(fā)展較為成熟，測序片斷較長，成本較低，但是只能測序，無法準(zhǔn)確定量，同時操作耗時、煩瑣、通量受局限，在臨床應(yīng)用不方便［8］。對Sanger 測序法和PCR-熒光探針法3 例不一致的樣本進(jìn)行分析，可能是PCR-熒光探針法和測序方法的檢測靶標(biāo)區(qū)域不同，兩者引物的檢測性能存在差異；另外，PCR-熒光探針法檢測靈敏度較測序方法靈敏度高，也可能導(dǎo)致低濃度樣本PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為陽性而測序方法檢測結(jié)果為陰性。

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)（PCR-熒光探針）的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的巨大飛躍，為樣品中靶標(biāo)序列或基因片段的精確定量提供了一種簡單而又方便的方法［9］。PCR-熒光探針技術(shù)以其操作簡便、檢測速度快、靈敏度高、同源分析特異性強(qiáng)、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具［10］，目前許多診斷應(yīng)用也相繼被開發(fā)。本研究通過三種方法同時檢測鼻咽拭子中的HRV，試驗(yàn)結(jié)果表明PCR-熒光探針法可靠、準(zhǔn)確、安全、簡便、穩(wěn)定，具有較高的臨床應(yīng)用價值。