阮菲 沈煒 周衛(wèi)民

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40 歲之前出現(xiàn)的卵巢儲(chǔ)備功能衰竭的一類(lèi)疾病，表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕甚至伴有圍絕經(jīng)期癥狀，醫(yī)學(xué)檢測(cè)一般為促卵泡生成素（FSH）升高、雌激素（E2）指標(biāo)下降等情況［1-2］，近年來(lái)，卵巢早衰的發(fā)病率成逐年上升和低齡化趨勢(shì)。卵巢早衰的發(fā)病因素復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制也不明確，已知的與遺傳、免疫、環(huán)境和不良生活方式、酶缺乏等因素相關(guān)，臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放化療、免疫制劑治療等因素導(dǎo)致的免疫性卵巢早衰占卵巢早衰發(fā)病率的10%～30%［3-4］，該類(lèi)患者早期不易診斷，后續(xù)治療比較困難。作者在長(zhǎng)期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)［5-10］，順鉑腹腔注射和雷公藤多苷口服灌胃制作的模型成模率高，而且模型較穩(wěn)定，因此本文擬對(duì)這兩種因素構(gòu)建的大鼠免疫性卵巢早衰模型進(jìn)行比較研究，并初步探討其發(fā)病機(jī)制，為治療免疫性卵巢藥物的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性SD 大鼠50 只，6～8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2018-0006］。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心［SYXK（浙）2018-0012］，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～69%，光照：12 h/12 h 明暗交替，噪聲＜50 dB；在獨(dú)立通氣籠具（IVC）內(nèi)自由進(jìn)食。所有實(shí)驗(yàn)步驟均按照中國(guó)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理的立法進(jìn)行，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（20190826-01）。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：順鉑（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，601191202），雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥股份有限公司，2005108B），烏拉坦（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20130609），蘇木色精（上海伯奧生物科技有限公司，180701），曙紅Y（國(guó)藥集團(tuán)話要試劑有限公司，20171112），補(bǔ)加樂(lè)（拜爾醫(yī)藥，20210119），F(xiàn)SH、促黃體生成素（LH）和E2試劑盒（南京建成）。（3）實(shí)驗(yàn)儀器：ASP200S 封閉式組織脫水機(jī)（Microm，德國(guó)）；包埋機(jī)（Microm，德國(guó)）；半自動(dòng)石蠟切片機(jī)（Microm，德國(guó)）；自動(dòng)染色劑（Microm，德國(guó)）；數(shù)字病理切片（熒光）掃描分析儀（VS120-S6-W，Olympus，日本）；Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR，Odyssey CLx），垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD，mini-PROTEAN），蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD，PowerPac）。

1.2 方法（1）動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)：SD 大鼠分為5組：正常組（n=16，8 只作為順鉑對(duì)照，8 只作為雷公藤多苷對(duì)照），雷公藤多苷模型組（7.5 mg/kg，灌胃，n=8），雷公藤多苷模型治療組（雷公藤多苷7.5 mg/kg，補(bǔ)佳樂(lè)0.15 mg/kg，灌胃，n=8），順鉑模型組（順鉑2 mg/kg，腹腔注射，n=8），順鉑模型治療組（順鉑2 mg/kg，腹腔注射，補(bǔ)佳樂(lè)0.15 mg/kg，灌胃，n=8）。雷公藤多苷灌胃14 d 后，治療組開(kāi)始灌胃給藥補(bǔ)佳樂(lè)21 d；順鉑腹腔注射7 d 后，治療組灌胃補(bǔ)佳樂(lè)21 d。（2）大鼠一般情況觀察：每?jī)商煊涗洿笫篌w重、活動(dòng)情況、毛色、糞便和死亡等情況。（3）大鼠動(dòng)情周期觀察：每天早上給藥前記錄陰道圖片，然后行HE 染色，顯微鏡下觀察大鼠動(dòng)情周期改變。（4）大鼠血清性激素測(cè)定：于造模前、造模完成后和給藥結(jié)束后大鼠眼眶后脈絡(luò)叢取血0.5 mL，分離血清，ELISA 法測(cè)定大鼠血清中FSH、LH 和E2的濃度。（5）大鼠卵巢組織臟器指數(shù)的測(cè)定：末次取血后，安樂(lè)處死大鼠，迅速分離大鼠卵巢組織，吸干表面血漬和組織液，稱重。將一側(cè)卵巢凍存于液氮中，一側(cè)卵巢組織用中性甲醛固定。臟器指數(shù)=雙側(cè)卵巢重量（g）/大鼠末次體重（g）×100%。（6）大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察：取一側(cè)卵巢進(jìn)行常規(guī)HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下行卵巢組織病理學(xué)觀察。將組織蠟塊行免疫組化染色后，高倍鏡下連續(xù)觀察5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞率作為觀察指標(biāo)。（7）大鼠卵巢組織免疫組化染色：取凍存的大鼠卵巢組織，提取蛋白后將蛋白煮沸變性，離心分取上清液，變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)不同抗體孵育后，激光成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖片分析用NDO.View2 處理。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 從表1、圖1 及實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)，順鉑模型組和順鉑治療大鼠體重從造模開(kāi)始下降，后緩慢上升，在尾部和腿部出現(xiàn)斑禿等脫毛現(xiàn)象，毛色暗淡，活動(dòng)減少；雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組大鼠體重緩慢增加，活動(dòng)減少，扎堆。末次稱重后，順鉑模型組和順鉑模型治療組的大鼠體重低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=8）；雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組體重與正常組相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=8）。結(jié)果顯示，順鉑誘導(dǎo)的免疫性卵巢早衰大鼠模型體重明顯降低。

圖1 各組大鼠體重變化折線圖

表1 各組大鼠體重?cái)?shù)據(jù)［（），n=8］

表1 各組大鼠體重?cái)?shù)據(jù)［（），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.05

2.2 大鼠動(dòng)情周期變化 正常組大鼠有規(guī)律的動(dòng)情周期平均為5～7 d；順鉑模型組和雷公藤多苷模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂，無(wú)明顯的規(guī)律，常見(jiàn)動(dòng)情間期和動(dòng)情前期的缺失；順鉑模型治療組動(dòng)情周期略有恢復(fù)，但是動(dòng)情間期時(shí)間延長(zhǎng)；雷公藤多苷模型治療組動(dòng)情周期略有恢復(fù)，但是動(dòng)情前期偶有缺失。結(jié)果表明兩種造模方式都可以引起大鼠動(dòng)情周期紊亂。

2.3 大鼠血清性激素測(cè)定 各組大鼠血清性激素水平見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

表2 各組大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與順鉑模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤多苷模型組比較，△P＜0.05

2.4 大鼠卵巢臟器指數(shù)的測(cè)定 順鉑模型組［（0.037±0.003）g/g］、順鉑模型治療組［（0.047±0.002）g/g］、雷公藤多苷模型組［（0.046±0.002）g/g］和雷公藤多苷模型治療組［（0.054±0.005）g/g］卵巢臟器指數(shù)小于正常組［（0.061±0.005）g/g］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與順鉑模型組比較，順鉑模型治療組、雷公藤多苷模型組和雷公藤多苷模型治療組卵巢臟器指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明兩種造模方法均可使大鼠卵巢指數(shù)降低。

2.5 大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察 從圖2 中可見(jiàn)，正常組大鼠卵巢中各級(jí)卵泡數(shù)量較多，可見(jiàn)成熟的卵泡；順鉑模型組大鼠卵巢組織中可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，初級(jí)卵泡和閉鎖卵泡較多，未見(jiàn)成熟的卵泡；順鉑模型治療組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，初級(jí)卵泡和閉鎖卵泡較多，偶見(jiàn)閉鎖的次級(jí)卵泡，未見(jiàn)成熟的卵泡；雷公藤多苷模型組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和閉鎖卵泡較多，未見(jiàn)成熟的卵泡；雷公藤多苷模型治療組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和閉鎖卵泡較多，可見(jiàn)閉鎖的成熟的卵泡。病理觀察顯示，兩種模型大鼠卵巢組織均有明顯損傷，出現(xiàn)卵巢早衰癥狀。

圖2 各組大鼠卵巢組織HE染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

2.6 大鼠卵巢組織免疫組化染色觀察 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值見(jiàn)表3。各組大鼠卵巢組織磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、PAKT、雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)（mTOR）免疫組化染色圖見(jiàn)圖3～6。

圖3 各組大鼠卵巢組織PI3K免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖4 各組大鼠卵巢組織AKT免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖5 各組大鼠卵巢組織pAKT免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

圖6 各組大鼠卵巢組織mTOR免疫組化染色（×100）（1.正常組；2.順鉑模型組；3.順鉑模型治療組；4.雷公藤多苷模型組；5.雷公藤多苷模型治療組）

表3 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值［n=5，（）］

表3 各組大鼠卵巢組織免疫組化染色總光密度數(shù)值［n=5，（）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與順鉑模型組比較，#P＜0.05；與雷公藤多苷模型組比較，△P＜0.05

3 討論

PI3K 和AKT 信號(hào)通路在卵巢組織中細(xì)胞增殖、凋亡和自噬過(guò)程最主要的信號(hào)通路之一，對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、原始卵泡的發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的增殖、分化均起到重要的作用［11-12］。mTOR 是PI3K/AKT 信號(hào)通路的下游蛋白，AKT 通過(guò)磷酸化的Ser-448 位點(diǎn)激活mTOR，進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)育，有研究表明，mTOR 活化水平下降可導(dǎo)致卵泡發(fā)育遲緩；mTOR 的過(guò)度表達(dá)可損傷亂丘細(xì)胞，進(jìn)而引起胰島素抵抗影響卵泡的正常發(fā)育；卵泡顆粒細(xì)胞中mTORC1 的過(guò)度活化加速了POF［11］。因此，PI3K/AKT-mTOR 信號(hào)通路在卵巢早衰中是比較敏感的存在。本實(shí)驗(yàn)大鼠卵巢組織的免疫組化染色驗(yàn)證了順鉑和雷公藤多苷均可以引起PI3K、AKT 的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常組，說(shuō)明順鉑和雷公藤多苷均可用于制作大鼠卵巢早衰模型。

雷公藤多苷是臨床常用的免疫性疾病治療藥物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用，文獻(xiàn)報(bào)道不良反應(yīng)發(fā)生率為58.1%［13］，以生殖系統(tǒng)毒性最為常見(jiàn)，臨床上常見(jiàn)育齡期婦女服用雷公藤導(dǎo)致月經(jīng)紊亂、月經(jīng)量少甚至閉經(jīng)的報(bào)導(dǎo)；有文獻(xiàn)研究顯示大鼠灌服雷公藤多苷后引起動(dòng)情周期紊亂、卵巢指數(shù)下降、雌激素和抑制素B 下降以及卵巢組織各級(jí)卵泡數(shù)減少和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)卵泡的病理改變［14-15］，與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果吻合，說(shuō)明雷公藤多苷灌胃可以制作穩(wěn)定的卵巢早衰模型。

順鉑是臨床常用的化療藥物，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也有不同的損傷作用，由于其對(duì)卵巢組織的損傷而被用于卵巢早衰動(dòng)物模型的制作，有研究表明順鉑可以不同程度的損傷不同發(fā)育時(shí)期的卵泡，抑制卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制卵巢功能，進(jìn)一步發(fā)展為排卵減少，導(dǎo)致血清中相應(yīng)的激素水平發(fā)生變化［16］。

通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，順鉑腹腔注射和雷公藤多苷均可制作穩(wěn)定的卵巢早衰模型，免疫組化染色顯示兩種藥物制作的卵巢早衰模型與大鼠卵巢組織中PI3KAKT-mTOR 信號(hào)通路相關(guān)。順鉑對(duì)大鼠卵巢的損傷更為嚴(yán)重，不僅模型大鼠出現(xiàn)斑禿、體重降低、卵巢指數(shù)降低外，而且外周血清性激素的恢復(fù)更緩慢，另外，大鼠卵巢組織HE 染色未見(jiàn)成熟的卵泡。雷公藤多苷制作的大鼠卵巢早衰模型較為溫和，對(duì)于藥物治療后血清性激素的改變、卵巢病理結(jié)構(gòu)的改變較為明顯，在本次實(shí)驗(yàn)中，更適合于藥物的篩選。