楊萍 戴澤 鄧凱莉 常秀春 王鳳 周玉平

肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的一種可逆性病理修復(fù)反應(yīng)，其主要的病理表現(xiàn)為肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過度增生、沉積與分布異常［1］。中醫(yī)藥抗肝纖維化具有一定優(yōu)勢(shì)，肝纖維化在中醫(yī)學(xué)多屬于“脅痛”、“積聚”范疇［2］。黃芪是臨床防治肝硬化方劑如黃芪湯、當(dāng)歸補(bǔ)血湯、861 方等名方的主藥，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效。黃芪總皂苷（Astragalosides，AST）是黃芪的主要有效成分之一，屬于單味藥物的組分復(fù)方配伍形式，諸多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AST 可通過抗氧化應(yīng)激、抑制膠原合成與肝星狀細(xì)胞活化等途徑逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化［3］。本課題組對(duì)AST 的抗纖維化作用進(jìn)行了多方面的探討，證實(shí)其可通過多種途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用［4-5］。本研究利用CCl4 化學(xué)誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型，從腺苷受體的角度進(jìn)一步解析黃芪總皂苷抗肝纖維化作用機(jī)制，為AST 的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用6～8 周SPF 級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)獲得寧波大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。（2）藥物：四氯化碳（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；索拉菲尼（純度≥99.0%，S5080，北京索萊寶生物科技有限公司）；黃芪總皂苷（H-045-160721，成都瑞芬思生物科技有限公司）。（3）主要試劑：蘇木精、麗春紅、苯胺藍(lán)病理染色試劑均購自美國Sigma；谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒（C009-2-1，南京建成生物工程研究所）；總膽紅素試劑檢測(cè)盒（C019-1-1，南京建成生物工程研究所）、白蛋白試劑檢測(cè)盒（A028-2-1，南京建成生物工程研究所）；RIPA 蛋白裂解液（P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（WC320140，thermo scientific）；蛋白分子量Marker（PR1910，北京索萊寶科技有限公司）；PVDF 膜（IPVH00010，Millipore）；超敏發(fā)光液（RJ239676，thermo scientific）；腺苷A2b 受體（Adora2b）（PA5-72850，thermo scientific）；Col1A（72026S，CellSignaling）；GAPDH（HC301，transgen）。

1.2 方法（1）動(dòng)物分組和處理：適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按體重隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組、肝纖維化模型組、黃芪總皂苷干預(yù)組、索拉菲尼干預(yù)組（n=8）。模型組與干預(yù)組小鼠腹腔注射15% CCl4-橄欖油溶液（2 mL/kg），3 次/周，持續(xù)5 周。黃芪總皂苷組和索拉菲尼組自造模第3 周首日開始灌胃給藥，1 次/d，給藥3 周，用雙蒸水溶解藥物制成合適的混懸液后，干預(yù)組分別給予黃芪總皂苷（164 mg/kg）、索拉菲尼（4 mg/kg），對(duì)照組與模型組灌以等體積雙蒸水。第5 周末戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，眼眶取血，切取肝臟最大葉放入福爾馬林溶液中固定；其余肝組織置于-80℃保存。（2）肝功能評(píng)價(jià)與肝組織病理學(xué)觀察：肝功能采用生化試劑盒檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBil）、白蛋白（ALb）等指標(biāo)，按照說明書進(jìn)行操作。肝組織經(jīng)脫水，石蠟包埋固定后切片，行蘇木精-伊紅染色和馬松染色，評(píng)價(jià)肝組織內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤情況與膠原增生情況。（3）免疫組化檢測(cè)Col1 蛋白表達(dá)：采用常規(guī)的免疫組化染色方法，石蠟切片經(jīng)過拷片、脫蠟、水化等預(yù)處理，滴加稀釋好（1 ∶200）的Col1 一抗4 ℃孵育過夜；滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（1 ∶100）/辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠孵育30 min，DAB 顯色、常規(guī)脫水、封片后置于鏡下觀察。（4）Western Blot 評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)Adora2b 和白介素-10（IL-10）蛋白表達(dá)：采用常規(guī)Western Blot 方法，將肝組織塊使用RIPA 裂解液裂解，SDS 凝膠電泳，采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將膜置于一抗（Adora2b、IL-10）溶液4℃孵育過夜，二抗溶液中室溫孵育，ECL 曝光液并于凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像。軟件分析各蛋白條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)分布與方差齊性，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清肝功能指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組血清肝功能指標(biāo)比較（）

表1 各組血清肝功能指標(biāo)比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

2.2 各組肝組織炎癥反應(yīng) HE 染色顯示，正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈、匯管區(qū)動(dòng)靜脈以及膽管結(jié)構(gòu)正常，少見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肝細(xì)胞可見大范圍變性壞死，匯管區(qū)由大量炎性細(xì)胞浸潤。黃芪總皂苷干預(yù)后，肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，匯管區(qū)有少量炎癥反應(yīng)，索拉菲尼有類似效果。結(jié)果提示，黃芪總皂苷和索拉菲尼能顯著抑制模型小鼠的肝臟炎癥反應(yīng)。見圖1。

圖1 各組肝組織炎癥表現(xiàn)（HE 染色，×100）。注：A.正常組；B.CCl4 模型組；C.黃芪總皂苷組；D.索拉菲尼組

2.3 各組肝組織膠原沉積和Col1 蛋白表達(dá)比較 Masson 染色結(jié)果提示，正常對(duì)照組小鼠肝組織中僅可見中央靜脈血管壁有少量膠原纖維藍(lán)染；而在模型組小鼠肝組織中，可見匯管區(qū)及中央靜脈周圍纖維間隔明顯增寬致密，有類似假小葉結(jié)構(gòu)產(chǎn)生；黃芪總皂苷與索拉菲尼干預(yù)后，肝纖維化模型小鼠肝組織膠原纖維間隔明顯變窄、變細(xì)、減少，不可見假小葉結(jié)構(gòu)。見圖2。免疫組化結(jié)果顯示，正常組小鼠僅在血管壁見I 型膠原（Col1）蛋白的表達(dá)；模型組則匯管區(qū)以及中央靜脈周圍可見較多的Col1 蛋白陽性表達(dá)；黃芪總皂苷和索拉菲尼組Col1 蛋白陽性表達(dá)較模型組明顯減少。結(jié)果提示，黃芪總皂苷和索拉菲尼能顯著抑制模型小鼠的肝纖維化進(jìn)展。見圖3。

圖2 各組肝組織膠原沉積比較（Masson 染色，×100）。注：A.正常組；B.CCl4 模型組；C.黃芪總皂苷組；D.索拉菲尼組

圖3 各組肝組織Col1 蛋白表達(dá)比較（免疫組化，×200）。注：A.正常組；B.CCl4模型組；C.黃芪總皂苷組；D.索拉菲尼組

2.4 各組肝組織Adora2b 和IL-10 蛋白表達(dá) Western Blot 結(jié)果顯示，模型組肝組織Adora2b 和IL-10 的蛋白表達(dá)較正常組明顯下降，黃芪總皂苷和索拉菲尼干預(yù)后能明顯逆轉(zhuǎn)這一變化，進(jìn)一步對(duì)電泳條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析顯示，藥物的逆轉(zhuǎn)作用具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 Western blot 檢測(cè) Adora2b 和IL-10 蛋白表達(dá)。注：A.正常組；B.黃芪總皂苷組；C.索拉菲尼組；D.CCl4 模型組

表2 各組小鼠肝組織Adora2b和IL-10蛋白相對(duì)表達(dá)量（）

表2 各組小鼠肝組織Adora2b和IL-10蛋白相對(duì)表達(dá)量（）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

3 討論

Adora2b 是四種腺苷受體（A1、A2A、A2B 和A3）之一［16］。由于Adora2b 親和力較其他三種受體低，且缺乏選擇性的配體，過去對(duì)Adora2b 的作用認(rèn)知較少；近年來由于Adora2b 基因敲除小鼠的構(gòu)建及其特異性選擇性激動(dòng)劑和抑制劑的應(yīng)用，Adora2b 研究取得了較大進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)Adora2b 在體內(nèi)各種組織和細(xì)胞廣泛存在，與細(xì)胞增殖與侵襲、血管新生、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控等病理過程密切相關(guān)［7］。研究顯示，Adora2b基因敲除后小鼠可表現(xiàn)出輕微的全身炎癥反應(yīng)，促炎細(xì)胞因子水平升高［8］。Adora2b 基因敲除小鼠還表現(xiàn)出糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，并激活經(jīng)典的巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［9］，上述研究說明Adora2b 可能具有抗炎效應(yīng)。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Adora2b 與器官纖維化相關(guān)。Adora2b 的激活可抑制內(nèi)皮素-1（ET-1）誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，并降低ET-1 下游 cAMP/Epac/PI3K/Akt 信號(hào)通路依賴的心臟成纖維細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白過表達(dá)［10］。雙敲除CD73 和Adora2b 通過激活蛋白激酶C-α，減少支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量和炎癥介質(zhì)IL-6 的產(chǎn)生，抑制吸煙引起的細(xì)支氣管纖維化樣病變［11］；腎成纖維細(xì)胞Adora2b 的激活可直接誘導(dǎo)腎間質(zhì)性纖維化［12］?？梢?，在不同組織或細(xì)胞及不同的病理過程中，Adora2b 可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。在乙醇聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝病模型中，CD39 的阻斷可抑制Adora2b 的激活，從而阻止肝星狀細(xì)胞活化與酒精性肝纖維化［13］。在膽汁性肝纖維化動(dòng)物模型中，腺苷可通過激活A(yù)dora2b 誘導(dǎo)IL-6 表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化［14］。本研究發(fā)現(xiàn)Adora2b 在單純CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型肝臟中的表達(dá)顯著降低，而黃芪總皂苷能顯著逆轉(zhuǎn)其表達(dá)含量的變化，故作者推測(cè)Adora2b 可能延緩單純CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化病理進(jìn)展，而表達(dá)含量變化的具體細(xì)胞種類與其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

IL-10 對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)與肝纖維化進(jìn)程具有保護(hù)作用［15］。NI 等［16］報(bào)道Adora2b 的抗炎機(jī)制可能與誘導(dǎo)IL-10 的產(chǎn)生有直接關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10 的蛋白表達(dá)在肝纖維化模型中與Adora2b 呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，都是顯著降低，且黃芪總皂苷能顯著提高其表達(dá)，基于上述文獻(xiàn)進(jìn)展和本研究結(jié)果，作者推測(cè)Adora2b 可能是抗肝纖維化的有效作用靶點(diǎn)，調(diào)控Adora2b/IL-10 信號(hào)通路可能是黃芪總皂苷發(fā)揮抗肝纖維化作用的機(jī)制之一。但是，本研究還只是初步的探索，未來還需通過基因敲除小鼠模型和體外的細(xì)胞生物學(xué)功能和機(jī)制研究，進(jìn)一步證實(shí)Adora2b/IL-10 信號(hào)通路在肝纖維化進(jìn)展中的作用及黃芪總皂苷的干預(yù)效應(yīng)。