孫俏潔 李祥平 楊群菲

喉癌（laryngeal cancer）為常見的頭頸部惡性腫瘤，據(jù)報道，喉癌的五年總體生存率為32%～70%，且男性患者多于女性［1］。喉癌患者確診后常需要接受手術(shù)、放射治療和化學治療。多西他賽（Docetaxel，DOC）為喉癌治療的一線化療藥物，可通過影響微管的聚合而發(fā)揮細胞毒作用，但仍有部分患者對DOC 不敏感［2］。因此，如何增強喉癌細胞對DOC 的敏感性是臨床治療亟待解決的問題。miR-122a 屬于轉(zhuǎn)錄本長度在22～25 nt 范圍內(nèi)的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。研究發(fā)現(xiàn)外源性過表達miR-122a 能顯著抑制喉癌細胞Hep2 的增殖能力［3］，但其抑制Hep2 細胞增殖的信號機制不完全清楚，其是否影響喉癌細胞對DOC 的敏感性暫無報道。為此，本研究以Hep-2 細胞為觀察對象，通過外源性過表達miR-122a，觀察細胞對DOC 的敏感性變化，同時對其作用機制進行研究，為臨床治療喉癌提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞 人喉癌細胞Hep-2（ATCC CCL-23）購自北納生物公司。

1.2 主要試劑 DOC 購自浙江海正藥業(yè)公司，miR-122a 慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購自山東維真生物公司，RPMI1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司，TRIZOL、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTFQ-PCR 試劑盒購自大連TaKaRa 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑購自上海碧云天公司，ECL 化學發(fā)光試劑盒購自美國Millipore 公司，表皮生長因子受體（EGER）抗體（4267S）、p-EGFR（3777S）、蛋白激酶B（AKT）抗體（4685S）、p-AKT 抗體（4060S）、抗兔IgG-HRP 抗體（7074S）、抗兔 IgG（H+L），F(xiàn)（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 594 Conjugate）（8889S）、抗兔IgG（H+L），（Alexa Fluor? 488 Conjugate）（4416S）購自美國CST 公司。

1.3 實驗儀器 CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司產(chǎn)品）；HERAguard ECO1.5 超凈工作臺（美國Thermo Scientific 公司產(chǎn)品）；Allegra 64R Centrifuge 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司產(chǎn)品）；ABI Prism?7300型熒光定量PCR儀（美國ABI公司產(chǎn)品）；Model550酶標儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽及轉(zhuǎn)印夾（美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品）；GE600 凝膠成像儀（美國GE 公司產(chǎn)品）。

1.4 實驗方法（1）細胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染及分組：人喉癌細胞Hep2 培養(yǎng)在含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5% CO2，95%相對濕度的培養(yǎng)箱。慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建miR-122a 過表達細胞：將載有miR-122a 的慢病毒和空載慢病毒稀釋5倍，分別加入Hep-2 細胞中培養(yǎng)細胞24 h，傳代兩次后以1 μg/mL 嘌呤霉素對細胞進行篩選。將過表達miR-122a 的Hep-2 細胞設為過表達組，轉(zhuǎn)染空白載體的細胞設為空載對照組，以未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組。（2）RTFQ-PCR 檢測細胞miR-122a 表達水平：培養(yǎng)空白對照組、空載對照組和過表達組細胞至對數(shù)期，收集細胞，TRIZOL 法提取細胞總RNA，將RNA 以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將miR-122a 正向引物和反向引物稀釋后按1 ∶1 混合，以RTFQ-PCR 試劑盒在ABI 7300 型實時熒光定量PCR 儀中進行擴增檢測，每組設置3 個重復孔。以U6 作為內(nèi)參，2-△△CT法計算miR-122a 的相對表達水平。miR-122a 引物序列如下，正向引物：5’-CAAGCGTTGGAGTGTGACA-3’，反向引物：5’-CGTCCTACCATTCTCCAGC-3’；內(nèi)參U6 引物如下，正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。（3）四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞活力：培養(yǎng)空白對照組、空載對照組和過表達組細胞至對數(shù)期，各組細胞按1×104個/孔接種于96 孔板中，每組細胞設7 個濃度梯度，每個濃度5 個重復孔。次日，將細胞更換為含0、0.5、1、5、10、20、50 mg/L DOC 的RPMI1640 培養(yǎng)基，同時設置調(diào)零孔和對照孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 時，每孔加入20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去細胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜。在酶聯(lián)免疫檢測儀A490 nm 處測量各孔的吸光值。制作細胞生長曲線，并計算各組細胞的細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。（4）結(jié)晶紫染色觀察細胞貼壁存活情況：培養(yǎng)空白對照組、空載對照組和過表達組細胞至對數(shù)期，各組細胞按5×105個/孔接種于6 孔板中，當匯合度達到60%～70%時，細胞同步化12 h。而后聚山梨酯-80（溶劑，1‰）和DOC（5.56 μg/mL）分別處理各組細胞24 h。處理結(jié)束后細胞PBS 洗3 遍，每孔加入1 mL 固定液（4%多聚甲醛）固定10 min，PBS 洗1 遍，各加入1 mL 結(jié)晶紫染色液染色10 min，雙蒸水洗兩遍，倒置顯微鏡下拍照。每組隨機視野拍照3～5 張，人工計數(shù)后計算細胞貼壁存活率。（5）蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測細胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達：培養(yǎng)各組細胞至對數(shù)期，按1×106個/皿接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，適時收集細胞，用RIPA 細胞裂解液提取總蛋白，12,000 r/min 離心20 min（r=8 cm），將上清液以BCA 蛋白定量試劑盒進行定量，制備含35 μg/15 μL 的蛋白樣品，100 ℃變性，采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5 %脫脂牛奶封閉過夜，次日孵育EGFR（1 ∶2,000）、p-EGFR（1 ∶1,000）、AKT（1 ∶3,000）、p-AKT（1 ∶1,000）或內(nèi)參抗體GAPDH（1 ∶5,000）3 h，TBST 洗膜3 次，孵育羊抗兔IgG-HRP 抗體1 h，TBST 洗膜3 次，以ECL 化學發(fā)光液進行顯色，GE600 凝膠成像儀下成像并讀取相應蛋白條帶。（6）免疫熒光法檢測細胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達：培養(yǎng)空白對照組、空載對照組和過表達組細胞至對數(shù)期，各組細胞按5×105個/孔接種于放置蓋玻片的6 孔板中，培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗1 遍，細胞以4 %多聚甲醛固定10 min，PBS 洗2 遍，取出載玻片并以0.5% TritonX-100 通透10 min，PBS 洗2 遍，以8%山羊血清封閉1 h，而后滴加p-EGFR（1 ∶500）和p-AKT（1 ∶500）4 ℃孵育過夜，PBST 洗3 遍，避光孵育熒光二抗（1 ∶300）1 h，PBTS 浸洗3 遍，DAPI染色5min，洗去DAPI 后封片，于倒置熒光顯微鏡下拍照并記錄熒光強度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較方法采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞miR-122a 表達水平差異 RTFQ-PCR結(jié)果顯示，空白對照組和空載對照組miR-122a 表達水平無明顯差異；與空載對照組比較，過表達組細胞miR-122a 表達明顯升高（F=264.9，P＜0.001），見圖1。

圖1 各組細胞miR-122a表達變化（注：與空載對照組比較，** P＜0.01。n=3）

2.2 DOC對各組細胞的IC50值的比較 MTT實驗結(jié)果顯示，DOC 對空白對照組、空載對照組及過表達組細胞的IC50 值分別為（15.26±2.13）μg/mL、（15.65±2.02）μg/mL 及（5.56±0.71）μg/mL?？瞻讓φ战M與空載對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與空載對照組比較，過表達組細胞IC50 明顯降低（F=32.24，P＜0.001），見圖2。

圖2 DOC處理后各組細胞活力曲線（注：n=6）

2.3 DOC 處理后各組細胞貼壁存活率差異 溶劑聚山梨酯-80（1‰）處理對各組細胞無明顯影響。以DOC（5.56 μg/mL）處理細胞24 h 后，空白對照組與空載對照組貼壁存活率無明顯差異；與空載對照組比較，過表達組細胞貼壁存活率明顯降低（F=123.5，P=0.001），見圖3。

圖3 DOC處理后各組細胞貼壁存活率（注：*P＜0.01，# P＜0.05，△P＜0.05。n=3）

2.4 各組細胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達變化 Western blot 結(jié)果顯示，空白對照組與空載對照組p-EGFR 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與空載對照組比較，過表達組細胞p-EGFR 蛋白表達明顯降低（F=85.32，P＜0.001）?？瞻讓φ战M與空載對照組p-AKT 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與空載對照組比較，過表達組細胞p-AKT 蛋白表達明顯降低（F=90.66，P＜0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示，與空載對照組比較，過表達組細胞p-EGFR 和p-AKT 熒光強度明顯降低（F=44.73，P＜0.001；F=52.47，P＜0.001），空白對照組和空載對照組無明顯差異。

3 討論

miR-122a 在調(diào)節(jié)糖尿病代謝、腸上皮通透性以及生殖細胞行為等方面發(fā)揮著重要作用［4］。研究報道，miR-122a 常在肝細胞癌中表達下調(diào)，并具有抑制肝癌細胞生長的生物學功能［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-122a 可靶向細胞周期蛋白G1 并下調(diào)后者的蛋白表達水平，從而影響正常的癌細胞周期進程［6］。提示miR-122a 可能作為一種抑癌信號分子參與惡性腫瘤細胞發(fā)展。

喉癌作為難治性惡性腫瘤，目前化療仍是其主要治療手段之一。然而，部分喉癌患者常對某些化療藥物（如DOC）不敏感，這限制了一些化療方案的應用。因此，如何解決喉癌對化療藥物的敏感性具有重要的臨床意義。本研究通過轉(zhuǎn)染法成功構(gòu)建了miR-122a 過表達的喉癌Hep-2 細胞，并發(fā)現(xiàn)DOC 對細胞的IC50 顯著下降，同時DOC 處理后細胞貼壁存活率明顯減少。提示過表達miR-122a 可增強Hep-2 細胞對DOC 的敏感性。

表皮生長因子受體（EGFR）是受體酪氨酸激酶的家族成員，表達于細胞膜，通過與配體結(jié)合而磷酸化激活［7］。EGFR 在多種細胞行為中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、分化、細胞代謝、遷移、周期調(diào)控等［7］?；罨腅GFR 能進一步磷酸化激活下游相關(guān)激酶通路，如MAPK、Akt 和JNK 通路，從而誘導細胞增殖［8］。研究顯示，外源性干擾EGFR蛋白表達可明顯增強肺癌A549細胞對化療藥物順鉑的敏感性［9］。提示抑制EGFR 與腫瘤細胞化療增敏有關(guān)。本研究進一步實驗發(fā)現(xiàn)，miR-122a 過表達后Hep-2 細胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表達明顯下調(diào)。提示miR-122a 能抑制EGFR-AKT 信號通路活化，這可能是Hep-2 細胞對DOC 敏感性增強的潛在分子機制。

綜上所述，miR-122a 可能通過抑制EGFR-AKT 信號通路增強Hep-2 細胞對DOC 的敏感性。本研究揭示了miR-122a 在喉癌細胞DOC 增敏中的可能機制，為臨床治療提供了一定的理論支持。但miR-122a 的下游信號機制還不夠完善，有待于進一步研究。