賈襲偉　贠小杰　久西加　徐寵然　劉源　毛潔　劉東　杜弢

摘要：半夏根尖染色體壓片效果受多重因素制約，為方便半夏染色體倍性鑒別、染色體計數，探索適用于半夏的根尖壓片技術選取半夏根尖為材料，采用植物染色體常規(guī)壓片法，對預處理液、預處理時間、固定時間、染色液以及染色時間5個主要參數進行一系列的篩選優(yōu)化。結果表明，在半夏根尖壓片過程中，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預處理3 h，卡諾氏固定液固定20.0 h，60 ℃水浴，1 mol/L鹽酸酸解10 min，45%醋酸軟化20 min，最后用改良石炭酸復紅染液染色20 min，壓片效果顯著，染色體清晰可辨，可用于半夏染色體觀察研究。

關鍵詞：半夏；根尖；壓片技術；染色方法

中圖分類號：S567? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）01-0094-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.01.021

Research on Chromosome Slicing Technology of Pinellia ternate

Root Tip Tissue

JIA Xiwei 1， YUN Xiaojie 1， JIU Xijia 1， XU Chongran 1， LIU Yuan 1， MAO Jie 1， LIU Dong 1， DU Tao 1， 2

（1. School of Pharmacy， Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou Gansu 730000， China; 2. Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract： The effect of Pinellia root tip chromosome compression is restricted by multiple factors. In order to facilitate the identification of Pinellia chromosomal ploidy and chromosome counting， a root tip compression technology suitable for Pinellia ternate was explored. In this experiment， the root tips of Pinellia ternate were selected as the material， and the routine pressing method of plant chromosomes was used. A set of technical methods for Pinellia root apex compression was developed. The experimental results showed that： in the process of root tip compression of Pinellia ternate， when pretreated with 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline solution for 3 h， fixed with Carnot's fixative for 20.0 h， water bath at 60 ℃， and acid hydrolyzed in 1 mol/L HCl for 10 min， softened in 45% acetic acid for 20 min， and finally stained with modified carbolic acid fuchsin for 20 min， the tableting effect was remarkable， and the chromosomes were clearly distinguishable， which can be applied to the observation and research of Pinellia ternate.

Key words： Pinellia ternate; Root tip; Tableting technique; Dyeing method

半夏來源于天南星科植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.） Breit.］的干燥塊莖，夏、秋兩季采挖，洗凈，除去外皮曬干。半夏始載于《神農本草經》，《禮記·月令》記載“五月半夏生，蓋當夏之半也，故名，又名守田、水玉，守田會意，水玉因形”［1 ］。其味辛，性溫；有毒，歸脾、胃、肺經。具燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結功效［2 ］，臨床常用以治療咳喘痰多、嘔吐反胃、胸脘痞悶、瘰疬痰核 等［3 ］。研究發(fā)現，半夏的不同居群、不同生態(tài)型之間染色體倍性混雜、數目多樣［4 ］，生產中，常因種源混亂影響半夏藥材產量［5 ］。目前對于半夏的研究，主要集中在藥理活性、化學成分鑒定及提取等方面，在染色體倍性以及形態(tài)等細胞遺傳學方面鮮有報道。

染色體是遺傳物質的主要載體，是細胞核中載有遺傳信息（基因）的物質，為細胞在有絲分裂或者減數分裂時DNA特定的存在形式。染色體的數目、形態(tài)及結構的變化導致遺傳信息發(fā)生改變，從而造成生物個體差異［6 - 7 ］。因此，探索并掌握染色體壓片技術方法，方便觀察、統(tǒng)計染色體的形態(tài)及數目，可有效解決細胞學研究和育種工作中染色體倍性鑒定、育種材料選擇以及親緣關系確定等技術難題。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

供試半夏是經甘肅中醫(yī)藥大學杜弢教授鑒定，為天南星科植物半夏［Pinellia ternata （Thunb.） Breit. ］的干燥塊莖，采自清水縣白沙鎮(zhèn)。

供試試劑有卡諾氏固定液（北京索萊寶科技有限公司）、過氧化氫（天津市大茂化學試劑有限公司）、1，4 二氯苯（北京沃凱生物科技有限公司）、1-溴化萘及8-羥基喹啉（薩恩化學技術有限公司）、考馬斯亮藍G250（天津市大茂化學試劑有限公司）、改良石炭酸復紅染液（北京索萊寶科技有限公司）、1 mol/L鹽酸、45%醋酸。

供試儀器設備有CX23正置顯微鏡（甘肅嘉瑞貿易有限公司）、載玻片、蓋玻片、試管、剪刀、鑷子、顯微鏡、擦鏡紙、香柏油、膠頭滴管。

1.2? ?方法

根尖染色體壓片的操作流程：取材→預處理→固定→酸解→軟化→染色→壓片→鏡檢、拍照［8 - 11 ］。

1.2.1? ? 取材? ? 將半夏種莖用毛刷于自來水中刷洗干凈，用1 g/kg的過氧化氫溶液浸泡20 min，再用無菌水沖洗5～6次，平鋪在放有5～6層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中（每皿5～6個），置于28 ℃培養(yǎng)箱中，每天定時補充水分以保持濾紙濕潤，3 d后有大量的新生根著生于半夏種莖芽點周圍。切取長2 cm的根尖（呈細長圓柱形，表面類白色，平滑，形態(tài)學上端類圓形），用蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.2.2? ? 預處理? ? 采用3種不同的預處理液，為對二氯苯飽和水溶液、α-溴萘和對二氯苯飽和水溶液的混合液、0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液。預處理時間設置為1.0、1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5 h共6個梯度。將切取的半夏根尖置于含有不同預處理液的試管中進行預處理。在每個預處理時間下分別壓片10張，觀察統(tǒng)計10張壓片中清晰可見的染色體總數目，比較半夏根尖染色體壓片的效果，從而選出最佳的預處理液。

1.2.3? ? 固定? ? 采用卡諾氏固定液在4 ℃的條件下固定。固定時間分別設置為14、16、18、20、22、24 h，共 6個梯度。將預處理結束的半夏根尖從試管中用鑷子夾出，用蒸餾水反復沖洗5～6次，置于含有卡諾氏固定液的試管中，按照試驗設計梯度進行固定。

1.2.4? ? 酸解? ? 將固定好的半夏根尖用蒸餾水反復沖洗5～6次，置于加有1 mol/L鹽酸的試管中，在60 ℃的水浴鍋中酸解10 min。

1.2.5? ? 軟化? ? 將酸解好的半夏根尖置于45%的醋酸中軟化20 min。

1.2.6? ? 染色? ? 采用改良石炭酸復紅染液、考馬斯亮藍G250染色液（配制方法：稱取考馬斯亮藍G250固體粉末10 mg，加入5 mL 90%乙醇進行溶解，然后加入5 mL 85%磷酸，最后加水定容到100 mL，振搖，4 ℃?zhèn)溆茫?。兩種染色液進行染色，染色時間均設置為5、10、15、20、25、30 min。比較染色結果的清晰程度，從而選出最佳染色液。

1.2.7? ? 壓片? ? 采用植物染色體常規(guī)壓片法。用刀片切取染色完成的半夏根尖分生區(qū)組織，放置在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用帶有橡皮的鉛筆均勻敲擊蓋玻片表面［12 ］，使其組織均勻分散在蓋玻片之間［13 ］，最終呈現出一層淡淡的薄霧狀，用濾紙擦去從邊緣滲透出來的染色液。

1.2.8? ? 鏡檢及拍照? ? 采用正置顯微鏡進行鏡檢，用JD capture軟件對染色體進行拍照記錄。

2? ?結果與分析

2.1? ?預處理液篩選

預處理的目的是抑制紡錘體的形成，使細胞分裂過程中的染色體縮短和比較分散，盡可能地使其分裂期停止于中期階段，從而便于觀察。3種預處理液對半夏根尖進行預處理的效果（表1）為0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液 > α-溴萘和對二氯苯飽和水溶液的混合液 > 對二氯苯飽和水溶液。在顯微鏡下觀察表明，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液處理的半夏根尖效果最好，視野中染色體形態(tài)、縊痕以及隨體清晰可見，染色體數目精確，便于計數分析；α-溴萘和對二氯苯飽和水溶液的混合液處理的半夏根尖部分染色體縮短變粗不明顯，呈線型的染色體纏繞在一起，不利于數目的統(tǒng)計分析；對二氯苯飽和水溶液處理的半夏根尖效果不佳，染色體同樣變粗不明顯，出現粘連現象。

2.2? ?預處理時間

預處理時間是預處理液發(fā)揮最佳效果的重要因素。由圖1可知，以0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液為預處理液時處理效果最佳。由表2可知，在0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預處理液中，預處理1.0 ～1.5 h時，鏡檢發(fā)現染色體形態(tài)較清晰；2.0 ～ 3.0 h時，染色體形態(tài)清晰； 3.5 h時，則染色體較模糊不清楚。對鏡檢觀察到的清晰染色體個數統(tǒng)計結果發(fā)現，預處理3.0 h時最多。因此，半夏根尖的最佳預處理時間為3.0 h。

2.3? ?固定時間

在用3種預處理液預處理的前提下，不同固定時間的固定效果見表3。從表3可知，以0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液為預處理液時，在預處理的前提下固定14 ～18 h，鏡檢發(fā)現染色體是一個漸變清晰的過程（從模糊到比較模糊再到比較清晰），不便于染色體形態(tài)的觀察以及計數；固定20 ～22 h，鏡檢時染色體清晰，利于觀察以及計數（圖2A、2B）；固定24 h，鏡檢時染色體變得比較模糊（圖2C、2D）。為了提高試驗的可靠性和準確性，半夏根尖的最佳固定時間為20 h。

2.4? ?染色液篩選

考馬斯亮藍G250染色液染出的半夏根尖效果不佳，鏡檢呈現區(qū)域白色或者藍色，看不到細胞核內的染色體形態(tài)（圖3A、3B）；改良石炭酸復紅染液染出的半夏根尖效果最佳，鏡檢時染色形態(tài)數目清晰可辨（圖4A、4B、4C、4D、4E、4F）。因此，改良石炭酸復紅染液為半夏根尖染色的最佳染色液。

2.5? ?染色時間

從表4可知，考馬斯亮藍G250的染色效果隨著染色時間延長，染色加深，但不論時間長短都不能清楚地看到細胞核內染色體形態(tài)。改良石炭酸復紅染液染色時，隨著染色時間的延長，染色同樣加深。染色5～15 min，染色較淺，不利于觀察；染色20 min，染色明顯，能清楚觀察到染色體的形態(tài)以及數目；染色25 min，染色體顏色較深，稍有模糊；染色30 min，染色體顏色過深，呈現區(qū)域紫色，染色體同時變得模糊，不利于染色體觀察以及計數。為了提高試驗的可靠準確性，20 min為半夏根尖的最佳染色時間。

3? ?討論與結論

影響植物根尖壓片效果優(yōu)劣的因素很多，比如選取壓片材料的生理狀況、取樣的時間、預處液的種類及濃度、預處理時間及溫度，固定液的種類、時間、溫度，解離的時間、溫度、染色液的種類、染色時間、溫度等條件［14 - 15 ］。其中每個操作步驟都非常重要，直接影響下一步的操作結果［16 - 17 ］。一般來說，植物細胞的分裂周期由一系列基因、酶和蛋白質精確調節(jié)，細胞分裂取決于DNA、RNA和蛋白質等細胞成分的定量合成，任何影響這些物質合成的因素都會影響細胞分裂，如溫度、營養(yǎng)、蛋白質抑制劑或核酸合成的抑制劑、植物激素等都會影響細胞分裂。因此，在半夏根尖的壓片中，筆者發(fā)現部分壓片透過燈光照射，呈現出絲狀，并不是淡淡的薄霧狀。對呈現絲狀的壓片鏡檢發(fā)現，染色體模糊，難以找到清晰的染色體，可觀察區(qū)域不連續(xù)，存在斷層現象，即使用帶橡皮的鉛筆用力敲擊，也不能使其呈現出淡淡的薄霧狀，從而影響鏡檢效果。對呈現淡淡薄霧狀的壓片鏡檢發(fā)現，染色體分布均勻，形態(tài)清晰，便于觀察以及計數。尋找其原因發(fā)現，雖然根尖由同一時間在同一半夏種莖上切取，但部分根尖粗壯，部分根尖細小，在解離以及軟化相同時間的情況下，對于稍微細小的半夏根尖足以將其軟化，但對于粗壯的根尖并不足以使其軟化。因此，對于材料的選擇至關重要，選擇形態(tài)大小相同的材料對于實驗的成功事半功倍。

通過觀察大量壓片發(fā)現，半夏根尖染色體壓片，其中有一部分染色體呈彎曲的線狀，扭曲纏繞在一起，同時細胞間的染色體重重疊疊，交叉纏繞在一起，非常不利于觀察以及計數。究其原因，很大可能是在壓片過程中用帶橡皮的鉛筆敲擊力度不夠，沒有使染色體充分分散開來；也有可能是在觀察過程中載玻片與蓋玻片錯位，導致此現象的出現。所以，在壓片以及觀察的過程要避免人為誤差。在觀察尋找典型分裂相細胞染色體時，有些壓片找不到典型分裂相細胞的染色體，有些壓片只能清楚地觀察到幾個典型分裂相細胞的染色體，而有些壓片則能觀察到許多典型分裂相細胞的染色體。這可能與取材時間和取材部位有關。查閱文獻發(fā)現，8：00 — 10：00時取材［12 - 13 ］，就有極大可能獲得處于細胞分裂各個時期的材料［18 ］。于是，我們分別在8：00 — 10：00時以及14：00 — 16：00時切取同一培養(yǎng)皿培養(yǎng)的半夏根尖部位，使用本試驗探索出的最佳條件進行處理，結果發(fā)現，8：00 — 10：00時取材的半夏根尖和14：00 — 16：00時取材的半夏根尖鏡檢并沒有發(fā)現明顯的差異，并沒有發(fā)現8：00 — 10：00時取材的半夏根尖比14：00 — 16：00時取材的半夏根尖有更多的典型分裂相細胞的染色體?？赡鼙驹囼炗玫陌胂母馀囵B(yǎng)在保溫箱里進行，溫度以及濕度變化不顯著，從而影響了半夏有絲分裂的進程，這與李淑潔［19 ］關于大麥根尖染色體研究發(fā)現的現象具有相似性；試驗樣本過少，缺乏有效性，精度不夠，有存在偶然誤差的可能，不具代表性。由于半夏的染色體相對比較小，通過顯微鏡觀察時具有很大的挑戰(zhàn)性。本試驗選擇改良石炭酸復紅染液，染色時間相對較短，鏡檢效果明顯，易于觀察，此方法方便簡單快捷。

染色體的倍性鑒定是倍性育種及其應用中不可缺少的工作。利用最方便、最快捷的方法盡早確定出植物的倍性水平，就能極大地減少工作量、避免盲目性、降低成本，加快育種工作的進程［20 ］。我們采用最方便快捷的壓片方法，通過對根尖染色體制片的5個主要參數預處理液、預處理時間、固定時間、染色液以及染色時間進行一系列合理的篩選優(yōu)化，探索出的適合半夏根尖的染色方法為半夏根尖用0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理3.0 h、卡諾氏液固定20 h，在60 ℃水浴，1 mol/L鹽酸中酸解10 min，45%的醋酸中軟化20 min，用改良石炭酸復紅染液染色20 min，壓片效果最佳。

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收稿日期：2022 - 07 - 26；修訂日期：2022 - 10 - 25

基金項目：國家中藥材產業(yè)技術體系建設專項資金資助（CARS-21）；2021年甘肅省第五批重點研發(fā)計劃項目（21YF5NA130）。

作者簡介：賈襲偉（1993 — ），男，甘肅環(huán)縣人，博士在讀，主要從事藥用植物資源保護與利用研究工作。Email： 1959322720@ qq.com。

通信作者：杜? ?弢（1967 — ），男，陜西鳳翔人，教授，碩士，主要從事藥用植物栽培及育種的教學和研究工作。Email： gslzdt@163.com。