丁國偉 李甜甜 徐萍 潘晨 王設(shè)市 魏榮榮 榮雪路 范娟

摘? 要：為構(gòu)建一種能夠用于開發(fā)豬細小病毒病毒樣顆粒疫苗的豬細小病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中的豬細小病毒全基因組序列設(shè)計并合成了１對能擴增VP2基因的引物，采用PCR擴增豬細小病毒BJ-2株的VP2基因，并將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacH TA中，獲得陽性質(zhì)粒pFastBac-PPV VP2；測序后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中，獲得含有VP2基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2；最后將獲得的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，并成功拯救了能穩(wěn)定表達豬細小病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒Bacmid-PPV VP2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該重組病毒可用于穩(wěn)定表達豬細小病毒VP2蛋白，并且表達的VP2蛋白可在體外自我組裝形成病毒樣顆粒，電鏡觀測其顆粒大小與豬細小病毒全病毒大小類似，且形成的病毒樣顆粒與全病毒一樣具有豚鼠紅細胞凝集作用，凝集效價可達1∶2 048。故構(gòu)建的表達豬細小病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒為研制豬細小病毒的基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬細小病毒；VP2基因；重組桿狀病毒；病毒樣顆粒

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）能導致初產(chǎn)母豬及血清學陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕以及產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔等[1]。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（porcine post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要發(fā)病原因是仔豬混合感染PPV與豬圓環(huán)病毒2型所致[2-3]。PPV具有極強的感染性和傳播性，一旦豬群中的某一頭豬感染PPV，豬群中其他豬在3個月內(nèi)都可能會感染。另外，PPV難以被清除，尤其是在該病毒流行的豬場，由其引發(fā)的母豬繁殖障礙能持續(xù)幾年甚至十幾年之久[4]。PPV在環(huán)境中具有極強的存活能力，對pH和溫度不敏感。除了對養(yǎng)豬企業(yè)的危害外，PPV也會嚴重危害生產(chǎn)豬細小病毒病疫苗的企業(yè)，在疫苗生產(chǎn)過程中一旦出現(xiàn)散毒或消殺不徹底的情況，將會極大影響后續(xù)生產(chǎn)。

PPV屬于細小病毒科細小病毒屬，無囊膜，病毒粒子呈二十面體對稱，直徑介于? ? ? ? ? 20～25 nm。PPV的基因組為單股負鏈DNA，5 000 bp左右，負鏈上沒有開放閱讀框（open reading frame，ORF），正鏈有2個ORF。5′端編碼三種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3，其中NS1蛋白與基因復制有關(guān)，其他兩個非結(jié)構(gòu)蛋白的功能尚不清楚[5-7]。3′端編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3，其中VP3蛋白由VP2蛋白水解產(chǎn)生，VP1蛋白與病毒復制有關(guān)，VP2蛋白在整個病毒衣殼中占據(jù)主要地位，擁有4個Loop環(huán)，抗原位點主要集中在這幾個環(huán)上，位于蛋白表面。PPV很多重要的線性表位在VP2蛋白上，病毒能夠利用VP2蛋白自我組裝成沒有核酸、不能自我復制的病毒樣顆粒（virus like particles，VLPs）[8]，同時誘導豬產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫[9]。

目前，預防豬細小病毒病主要采用接種疫苗進行干預，市場上主要使用的豬細小病毒病疫苗為滅活疫苗。該疫苗雖然能夠有效控制PPV的臨床感染，但對疫苗生產(chǎn)企業(yè)而言，存在生物安全風險[10]。所以，研制安全、新型的豬細小病毒病疫苗對控制和徹底消滅此病具有重要意義[11]。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達VP2蛋白，利用間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）、透射電鏡（transmission electron micrograph，TEM）、豚鼠紅細胞凝集試驗等方法觀察和分析VP2蛋白的表達情況，為后續(xù)研究豬細小病毒的病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌種和細胞

PPV BJ-2株由揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司保存；Sf9昆蟲細胞、大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞、pFastBac Ⅰ均購自Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、T4連接酶、DNA凝膠純化試劑盒、ProteinFind Anti-His單克隆抗體和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗鼠IgG均購自北京全式金公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；昆蟲細胞培養(yǎng)基（Grace）和轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ購自Invitrogen公司；抗PPV陽性血清購自國生生物；FITC標記的山羊抗豬IgG購自Southern Biotechnology公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

設(shè)計并合成一對擴增PPV VP2基因的引物，引物序列為：

VP2-F：5-CGCGGATCCATGTCTGAGAACGTGGAAC-3，VP2-R：5-CCCAAGCTTTTAGTACAGC TTTCTAGGG-3。

其中加粗堿基為保護性堿基，上、下游引物的斜體堿基分別為BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。合成M13通用引物，引物序列為：

M13-F：5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC- 3，M13-R：5-CAGGAAACAGCTATGACC-3。

1.2.2 PPV VP2基因的擴增及桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

以提取的PPV基因組DNA為模板擴增VP2基因。將純化的PCR產(chǎn)物和轉(zhuǎn)移載體pFastBacⅠ經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后分別回收目的片段并連接，構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PPV VP2，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，取經(jīng)PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒送南京金斯瑞生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2的構(gòu)建及鑒定

將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PPV VP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中，并涂于含有卡那霉素（Kan+）、慶大霉索（G+）、四環(huán)素（T+）、X-Gal和異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）的盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基篩選平板上，37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，挑取白色菌落并進行2次純化，根據(jù)Bac to Bac表達系統(tǒng)說明書，提取含有VP2基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2，同時轉(zhuǎn)化pFastBacⅠ作為陰性對照，并提取僅含有His標簽的重組質(zhì)粒Bacmid-HTA，用M13通用引物進行PCR鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)染、收獲重組桿狀病毒

根據(jù)Cellfectin Ⅱ說明書將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲細胞。轉(zhuǎn)染后置于27 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h以上，直至細胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹?，收集細胞上清，即為P1代重組桿狀病毒。P1代病毒在Sf9昆蟲細胞上經(jīng)2次傳代擴增后，即為P3代重組桿狀病毒。

1.2.5 間接免疫熒光檢測VP2蛋白的表達

以P3代重組桿狀病毒感染對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞，同時以野生型桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞作為陰性對照，以未接種病毒的正常Sf9昆蟲細胞作為空白對照，27 ℃下培養(yǎng)48 h以上，待接種病毒的細胞發(fā)生較明顯的病變時收集上清，保留細胞，用間接免疫熒光試驗分別對VP2蛋白和His標簽進行檢測。對VP2蛋白表達的檢測：細胞用－20 ℃預冷的丙酮-乙醇（體積比4∶1）混合液4 ℃下固定30 min；PBS清洗3次，甩干后加入按1∶? 1 000稀釋的抗VP2陽性血清，37 ℃下孵育? 1 h；PBS清洗3次，甩干后加入按1∶200稀釋的FITC標記的山羊抗豬IgG，37 ℃下孵育1 h；PBS洗３次后于熒光顯微鏡下觀察。對His標簽表達的檢測：細胞用－20 ℃預冷的丙酮-乙醇（體積比4∶1）混合液4 ℃下固定30 min；PBS清洗3次，甩干后加入按1∶200稀釋的ProteinFind Anti-His單克隆抗體；37 ℃下孵育1 h；PBS清洗３次，甩干后加入按1∶200稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，37 ℃下孵育1 h；PBS洗? 3次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 VLPs純化及鑒定

使用分子篩進行病毒樣顆粒純化，并收集純化樣本，經(jīng)磷鎢酸負染色處理，使用透射電鏡觀察病毒樣顆粒的組裝情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1 PPV VP2基因擴增與克隆

PCR擴增獲得1條1 740 bp的DNA產(chǎn)物（圖1），與預期擴增片段大小一致。由圖2可知，用pFastBac F/R通用引物對重組轉(zhuǎn)移載體進行鑒定，結(jié)果獲得1 740 bp的目的條帶，陽性克隆測序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PPV VP2。

2.2 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2的鑒定

將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-PPV VP2及空載體pFastBacH TA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，并通過藍白斑篩選3次后提取質(zhì)粒，經(jīng)M13通用引物進行PCR鑒定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，pFastBac-PPV VP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞后提取的質(zhì)粒利用M13通用引物可以擴增出4 000 bp左右的條帶，而pFastBacH TA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞提取的質(zhì)粒僅能擴增出2 300 bp左右的條帶，從而證明了重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)染和VP2蛋白表達檢測

將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，同時設(shè)立陰性對照孔。轉(zhuǎn)染72 h后，轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-PPV VP2的Sf9昆蟲細胞開始變大、變圓、空泡化，結(jié)果表明已成功拯救表達VP2蛋白的重組桿狀病毒rBac-PPV VP2。將成功拯救的重組桿狀病毒rBac-PPV VP2在Sf9昆蟲細胞上傳至第3代，然后檢測目的蛋白的表達情況。分別利用抗PPV陽性血清和ProteinFind Anti-His單克隆抗體作為一抗，然后利用相應(yīng)的熒光二抗進行檢測，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，rBac-PPV VP2接種Sf9昆蟲細胞后熒光檢測結(jié)果均為陽性，而野生型桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞及未接種病毒的正常Sf9昆蟲細胞均未出現(xiàn)熒光，表明PPV VP2蛋白成功表達。

2.4 重組蛋白VP2-VLP純化的TEM觀察

通過分子篩的流穿物形成了4個波峰，第一個波峰在1/3柱體積處出峰，由于病毒樣顆粒具有較大的分子量，理論上第一個波峰應(yīng)該是病毒樣顆粒，而其他波峰是其他雜蛋白分子（圖5）。我們將第1個波峰流出的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳時發(fā)現(xiàn)，第一個波峰中全部為與PPV VP2大小相同的蛋白（圖6），并且檢測其血凝價發(fā)現(xiàn)，其血凝價為1∶2 048。電鏡觀察結(jié)果顯示，第一個波峰流出的VP2蛋白自我組裝形成了VLPs，該VLPs大小與PPV全病毒具有相同的直徑，在20 nm左右（圖7）。以上結(jié)果表明，桿狀病毒表達系統(tǒng)可以成功表達VP2蛋白，并且表達的VP2蛋白可以自我組裝成VLPs，而VLPs的形成可以有效地提高單一蛋白的免疫效果。

3 討論

病毒樣顆粒是一種近年來研究很火的安全有效的納米材料[12]。它沒有病毒核酸，不能自主復制，沒有感染性，但能同時誘導動物機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答，所以，其作為一種新型疫苗進行研制具有重要的臨床應(yīng)用價值。具有高感染率的PPV會嚴重影響豬的生產(chǎn)性能和豬場的經(jīng)濟效益，給豬接種滅活疫苗雖然能夠控制病毒的流行，但是存在一定的生物安全風險，所以開發(fā)新型安全的豬細小病毒病疫苗勢在必行。近年來，研究人員使用不同表達系統(tǒng)使PPV VP2在體外組裝形成了VLPs，并且對豚鼠和豬都產(chǎn)生了高特異性抗體水平。

作為一種蛋白表達手段，昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用到多個領(lǐng)域，隨著該系統(tǒng)的不斷完善及研發(fā)成本的逐步降低，其受到獸用生物制品研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注。該系統(tǒng)在獸用生物制品中的應(yīng)用典型例子是PCV2亞單位疫苗的生產(chǎn)，德國勃林格殷格翰公司生產(chǎn)的PCV2亞單位疫苗因其具有良好的免疫保護效果以及較短的免疫應(yīng)答時間等特點得到了廣泛應(yīng)用。本研究基于Bac to Bac系統(tǒng)成功表達出了PPV VP2蛋白，并且研究發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒，與天然PPV結(jié)構(gòu)類似，透射電鏡和動態(tài)光散射檢測結(jié)果表明，制備的VLPs大小約20 nm，結(jié)構(gòu)均一、形狀規(guī)則，且具有血凝活性，說明該VLPs能夠正確展示PPV的血凝活性表位，與前述桿狀病毒表達系統(tǒng)中獲得的VLPs結(jié)構(gòu)類似，為進一步研發(fā)PPV VP2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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