馮潤(rùn)滋 杜敏 陳誠(chéng) 馬子玥 周雪平 楊秀玲

摘要 為明確南瓜葉片上卷、黃化的癥狀是否由病毒侵染引起，本研究采用小RNA深度測(cè)序?qū)Σ杉躁兾鞯貐^(qū)的南瓜葉片樣品進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，侵染南瓜樣品的病毒可能是中國(guó)南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus， SLCCNV）。經(jīng)PCR擴(kuò)增并且克隆測(cè)序獲得了病毒的DNA-A和DNA-B組分的全基因組序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所克隆的DNA-A組分與SLCCNV海南分離物（SLCCNV-Hn61）DNA-A的一致性最高，為99.1%;DNA-B組分與SLCCNV-Hn61和三亞分離物SLCCNV-SY的DNA-B組分一致性最高，為96.8%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)所克隆的DNA-A和DNA-B組分分別與SLCCNV-Hn61和SLCCNV-SY的親緣關(guān)系最近。以上研究結(jié)果表明侵染陜西南瓜葉片的病毒是SLCCNV的分離物。這是首次報(bào)道SLCCNV在陜西地區(qū)的危害，研究結(jié)果為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)作物南瓜的病害防控提供參考。

關(guān)鍵詞 中國(guó)南瓜曲葉病毒;?小RNA深度測(cè)序;?PCR;?基因組序列

中圖分類號(hào)： S 436.412.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022008

Abstract To determine whether the leaf curling and yellowing symptoms of pumpkin plants are caused by virus infection， small RNA-based deep sequencing was performed in this study. Analysis of the deep sequencing data indicated that the collected pumpkin plants were potentially infected by squash leaf curl China virus （SLCCNV）. The complete genome sequences of DNA-A and DNA-B components were obtained by PCR amplification， cloning， and sequencing. Sequence comparison showed that the DNA-A component shared the highest sequence identity （99.1%） with the Hainan isolate of SLCCNV （SLCCNV-Hn61）， and the DNA-B component had the highest sequence identity （96.8%） with SLCCNV-Hn61 and the Sanya isolate of SLCCNV （SLCCNV-SY）. Phylogeny analysis showed that the complete genome sequences of DNA-A and DNA-B components were most closely related to the Hainan and Sanya isolates of SLCCNV， respectively. These results suggest that the virus identified in this study is an isolate of SLCCNV. This is the first report of the occurrence of SLCCNV in Shaanxi， China， which provides a reference for the prevention and control of the local pumpkin disease.

Key words squash leaf curl China virus;?small RNA deep sequencing;?PCR;?genome sequence

雙生病毒是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子大小為22 nm×38 nm［1］。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的最新報(bào)告，雙生病毒有520種，是迄今為止種類最多的植物病毒［1］?；诨蚪M結(jié)構(gòu)、介體種類以及寄主范圍，雙生病毒科Geminiviridae被劃分為14個(gè)屬，包括菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus、玉米線條病毒屬M(fèi)astrevirus、甜菜曲頂病毒屬Curtovirus、番茄偽曲頂病毒屬Topocuvirus、伊朗甜菜曲頂病毒屬Becurtovirus、蕪菁曲頂病毒屬Turncurtovirus、彎葉畫眉草條紋病毒屬Eragrovirus、葡萄紅斑病毒屬Grablovirus、美杜莎大戟潛隱病毒屬Capulavirus、柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒Citlodavirus、蘋果病毒屬M(fèi)aldovirus、桑皺葉病毒屬M(fèi)ulcrilevirus、仙人掌病毒屬Opunvirus、番茄頂端曲葉病毒屬Topilevirus［2］。其中，菜豆金色花葉病毒屬的成員最多，包含了445種病毒，對(duì)國(guó)內(nèi)外的番茄、木薯和棉花等作物造成毀滅性危害。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)的不同菜豆金色花葉病毒屬病毒可以分為2類［3］：一類為雙組分雙生病毒，其含有大小相近（約2.6 kb）的DNA-A和DNA-B組分;另一類為單組分雙生病毒，只含有一個(gè)基因組，類似于雙組分雙生病毒的DNA-A組分，大小約為2.7 kb。很多單組分雙生病毒還伴隨有大小約為1.3 kb的衛(wèi)星分子，包括alpha衛(wèi)星和beta衛(wèi)星。

中國(guó)是世界上最大的南瓜生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)［4］。南瓜的果實(shí)既可以食用也可以藥用，是一種具有重要發(fā)展前景的作物。近年來(lái)，南瓜病毒病發(fā)生愈發(fā)嚴(yán)重，成為制約南瓜產(chǎn)量的主要因素之一。據(jù)報(bào)道有80多種病毒能夠引起南瓜病害，包括黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus， WMV）、南瓜花葉病毒（squash mosaic virus， SMV）和馬鈴薯Y病毒（potato virus Y， PVY）等［5］。中國(guó)南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus， SLCCNV）是菜豆金色花葉病毒屬的雙組分雙生病毒，由煙粉虱Bemisia tabaci傳播，侵染南瓜、甜瓜和西葫蘆等多種葫蘆科作物，引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。SLCCNV于1994年在我國(guó)廣西南寧的南瓜植株上被首次發(fā)現(xiàn)［6］，之后在云南的南瓜［7］、海南的甜瓜［8］等作物中被發(fā)現(xiàn)。除此之外，SLCCNV還對(duì)菲律賓［9］、印度［10］等地的南瓜、西葫蘆等作物造成危害，成為制約葫蘆科作物特別是南瓜作物生產(chǎn)的重要因素。

本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)從陜西省表現(xiàn)黃化、葉片卷曲的南瓜樣品中鑒定到SLCCNV，并利用PCR等方法獲得了SLCCNV DNA-A和DNA-B組分的全長(zhǎng)序列和基因組結(jié)構(gòu)。這是首次報(bào)道SLCCNV在陜西的危害。

1?材料與方法

1.1?材料來(lái)源

2020年9月從陜西省采集到3株具有黃化、葉片卷曲等疑似被病毒侵染癥狀的南瓜病株（圖1），將樣品分別編號(hào)為SX01、SX02、SX03。

1.2?小RNA深度測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

小RNA深度測(cè)序在北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行。每個(gè)南瓜樣品取0.2 g葉片混合后利用TRIzol法提取總RNA并進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。試驗(yàn)流程主要分為4步： 1）提取樣品總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。質(zhì)量檢測(cè)主要包括RNA中是否含有雜質(zhì)，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA是否被降解;2）將質(zhì)檢合格的RNA用于文庫(kù)構(gòu)建;3）對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)并進(jìn)行HiSeq測(cè)序; 4）對(duì)小RNA進(jìn)行拼接，拼接得到的contigs在NCBI中進(jìn)行BLAST檢索。

1.3?植物總DNA的提取

感病南瓜樣品的總DNA采用CTAB法提?。?1］。用RNAase去除DNA中的RNA并測(cè)定濃度后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，檢測(cè)合格后保存在-20℃冰箱。

1.4?PCR擴(kuò)增克隆及序列測(cè)定

根據(jù)小RNA測(cè)序拼接得到的病毒核苷酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA-A的特異性背靠背引物（DNA-A-F：5′-GAACTGGATAAGAACGTGGATATGC-3′; DNA-A-R：5′-AGTTCGAAGGAAAGTTCCAATGCAA-3′）以及擴(kuò)增DNA-B的特異性背靠背全長(zhǎng)引物（DNA-B-F：5′-CGTGTCTCCCTCCGTCAATC-3′;DNA-B-R：5′-ACGAAACAAGCAGA-GTTCACAATTC-3′）。以南瓜樣品的總DNA為模板，分別擴(kuò)增DNA-A和DNA-B組分以獲得病毒的全基因組序列。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的條帶，純化后連接到pEASY-Blunt Zero克隆載體（北京全式金公司）上，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，以M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）和M13R（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）為引物，用TaqPCR mix（生工）進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑選2個(gè)陽(yáng)性單克隆提取質(zhì)粒，送到北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5?病毒DNA-A和DNA-B的序列分析

將測(cè)序獲得的SLCCNV的DNA-A和DNA-B的全長(zhǎng)核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST檢索，用SnapGene軟件將獲得的序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，并利用ORF Finder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測(cè)DNA-A和DNA-B的基因組結(jié)構(gòu)。運(yùn)用SDT軟件［12］對(duì)得到的南瓜病毒分離物基因組序列與其他SLCCNV不同分離物的基因組序列進(jìn)行比對(duì)。選取已報(bào)道的SLCCNV其他分離物的代表性同源序列，利用MEGA 7.0軟件［13］對(duì)SLCCNV陜西分離物的DNA-A和DNA-B核苷酸全長(zhǎng)序列以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以泰國(guó)番茄黃曲葉病毒tomato yellow leaf curl Thailand virus （TYLCTHV）作為外群，bootstrap設(shè)置為1 000。

2?結(jié)果與分析

2.1?感病南瓜葉片小RNA高通量測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)表現(xiàn)黃化、葉片卷曲的南瓜葉片進(jìn)行小RNA文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序，共得到15 086 924條小RNA（raw reads），過(guò)濾掉含N量超過(guò)10%、質(zhì)量低、僅含有5′接頭和3′接頭、沒(méi)有插入片段以及含有polyA/T/G/C的小RNA后保留了14 910 330條有效小RNA，占總小RNA數(shù)的98.83%。小RNA的長(zhǎng)度主要集中在18～26 nt，共有8 888 734條，其中主要長(zhǎng)度為21 nt，占小RNA總數(shù)的19.04%;18、19、20、22 nt和23 nt的小RNA的比例也都超過(guò)了10%;24 nt的小RNA占9.75%（圖2）。

利用Velvet軟件［14］，用參數(shù)k-mer 17對(duì)18～26 nt的小RNA進(jìn)行拼接，共得到379條contigs。在NCBI中BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，與SLCCNV有較高一致性的contigs有29條。其中，比對(duì)到SLCCNV DNA-A組分的有13條，覆蓋了SLCCNV DNA-A組分的1 277 nt，覆蓋比例占全長(zhǎng)基因組的46.67%;比對(duì)到SLCCNV DNA-B組分的有16條，覆蓋了SLCCNV DNA-B組分的1 495 nt，覆蓋比例占全長(zhǎng)基因組的53.65%。

2.2?DNA-A和DNA-B全長(zhǎng)基因組序列的克隆

根據(jù)小RNA測(cè)序得到的序列，設(shè)計(jì)了病毒特異性全長(zhǎng)引物DNA-A-F/-R和DNA-B-F/-R，以感病南瓜樣品的總DNA為模板，利用DNA-A-F/-R引物擴(kuò)增獲得2條全長(zhǎng)序列DNA-A-SX01-1和DNA-A-SX02-1;利用DNA-B-F/-R引物擴(kuò)增共獲得1條全長(zhǎng)序列DNA-B-SX01-2。將擴(kuò)增到的條帶回收，連接到pEASY-Blunt Zero克隆載體后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，利用SnapGene軟件進(jìn)行拼接，得到2條全長(zhǎng)均為2 736 bp的DNA-A組分（登錄號(hào)： OM100574）和全長(zhǎng)為2 718 bp的DNA-B組分 （登錄號(hào)： OM100575）。

對(duì)所獲得的DNA-A組分的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA-A-SX01-1和DNA-A-SX02-1的一致性為99.5%。后續(xù)以DNA-A-SX01-1為代表進(jìn)行分析。利用BLAST比對(duì)以及SDT軟件分析，發(fā)現(xiàn)DNA-A-SX01-1與分離自海南地區(qū)的SLCCNV（SLCCNV-Hn61）的DNA-A組分的一致性最高，達(dá)99.1%，與海南分離物SLCCNV-Hn，云南、廣東和廣西地區(qū)的分離物一致性在95%～99%，與來(lái)自其他地區(qū)的SLCCNV分離物的一致性都在90%以上;與其他國(guó)家的分離物相比，DNA-A-SX01-1與越南和泰國(guó)的分離物一致性在95%以上，與印度尼西亞、印度、馬來(lái)西亞、菲律賓的分離物的一致性在92%～94%之間（表1）。

對(duì)DNA-B組分的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA-B-SX01-2序列與海南分離物SLCCNV-Hn61和三亞分離物SLCCNV-SY的一致性最高，達(dá)96.8%;與海南分離物SLCCNV-Hn的一致性為94.7%，與廣西和廣東分離物的一致性較低，僅分別為87%和86.2%。與其他國(guó)家的分離物相比，DNA-B-SX01-2序列與越南分離物SLCCNV-B的一致性較高（達(dá)92%），而與印度尼西亞分離物（SLCCNV-Basq-17）、印度分離物（SLCCNV-Pumpkin：Combatore）和泰國(guó)分離物（SLCCNV-KN44）DNA-B組分的序列一致性不到90%（表2）。

2.3?DNA-A和DNA-B組分的基因組結(jié)構(gòu)和序列分析

對(duì)DNA-A-SX01-1和DNA-B-SX01-2全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA-A-SX01-1具有菜豆金色花葉病毒DNA-A組分的典型結(jié)構(gòu)特征，共編碼了7個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORFs），其中病毒鏈編碼AV1（279－1 049 nt）和AV2（41－457 nt），互補(bǔ)鏈編碼AC1（1 507－2 583 nt）、AC2（1 191－1 595 nt）、AC3（1 046－1 456 nt）、AC4（2 250－2 426 nt）、AC5（309－827 nt）。DNA-B-SX01-2共編碼2個(gè)開(kāi)放閱讀框，病毒鏈編碼BV1（479－1 285 nt），互補(bǔ)鏈編碼BC1（1 338－2 183 nt）。DNA-A和DNA-B在編碼鏈和互補(bǔ)鏈的非編碼區(qū)存在一個(gè)高度保守的共同區(qū)（common region， CR）（圖3）。

對(duì)DNA-A和DNA-B組分編碼的ORF進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA-A-SX01-1中AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、AC5編碼的氨基酸是比較保守的，最為保守的是AV1、AC3和AC4，與其他分離物相應(yīng)基因一致性都在90%以上，AV2與其他分離物的一致性在74.8%～99.3%之間，AC1與其他分離物的一致性在75.8%～99.4%之間，AC2與其他分離物的一致性在88.2%～100%之間，有的分離物不編碼AC5，除了SLCCNV-SY，與其他SLCCNV分離物 DNA-A組分編碼的AC5蛋白的氨基酸序列的一致性均在90%以上（表1）。

2.4?DNA-A和DNA-B組分的核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)獲得的陜西分離物的全基因組與世界各地具有代表性的SLCCNV分離物的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于全基因組核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4，5）。從進(jìn)化樹(shù)中看出， 根據(jù)分離物的地理位置DNA-A組分主要分為4個(gè)大支，分別為：來(lái)自中國(guó)大陸地區(qū)、越南和泰國(guó)的分離物;來(lái)自東帝汶和馬來(lái)西亞的分離物;來(lái)自菲律賓和中國(guó)臺(tái)灣的分離物;來(lái)自印度和孟加拉國(guó)的分離物。此外，陜西分離物的DNA-A組分與來(lái)自中國(guó)海南的分離物親緣關(guān)系較近，且與海南分離物SLCCNV-Hn61（AM260205.1）和SLCCNV-Hn（MF062251.1）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

DNA-B組分的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）主要分為2個(gè)大支：一支包括來(lái)自印度、孟加拉國(guó)和巴基斯坦的分離物;一支包括來(lái)自中國(guó)、越南和印度尼西亞的分離物。此外，陜西分離物的DNA-B組分與采集自中國(guó)海南的分離物SLCCNV-Hn61（AM260207.1）和SLCCNV-SY（KF99984.1）的親緣關(guān)系較近，其中與SLCCNV-SY的親緣關(guān)系最近。結(jié)合序列一致性的分析結(jié)果以及國(guó)際病毒分類委員會(huì)的分類標(biāo)準(zhǔn)，從陜西感病南瓜分離的病毒為SLCCNV的一個(gè)分離物，命名為中國(guó)南瓜曲葉病毒陜西分離物（squash leaf curl China virus， Shaanxi isolate， SLCCNV-SX-01）。

3?結(jié)論與討論

中國(guó)南瓜曲葉病毒（SLCCNV）影響南瓜的產(chǎn)量，其最早于1994年在中國(guó)被發(fā)現(xiàn)［6］，隨后在泰國(guó)［15］、菲律賓［9］、印度［10］、巴基斯坦［16］等國(guó)家發(fā)生危害。目前，SLCCNV在我國(guó)海南、云南、廣東、廣西等省區(qū)都有發(fā)現(xiàn)［6-8，17］。本研究通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)SLCCNV陜西分離物的DNA-A的全長(zhǎng)核苷酸序列與SLCCNV-Hn61的一致性最高，DNA-B的全長(zhǎng)核苷酸序列與SLCCNV-SY和與SLCCNV-Hn61的一致性最高。根據(jù)ICTV的分類標(biāo)準(zhǔn)，雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬病毒的全基因組核苷酸序列同源性大于91%，則認(rèn)為是同種病毒，若核苷酸序列一致性介于91%～94%之間，則屬于同種病毒的不同株系，大于94%則認(rèn)為是屬于同種病毒的不同分離物［18］。鑒于此，從陜西南瓜樣品上分離的病毒確定為SLCCNV的不同分離物。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，SLCCNV陜西分離物與我國(guó)海南分離物具有最近的親緣關(guān)系，且采集自不同地區(qū)的SLCCNV分離物DNA-A和DNA-B組分呈現(xiàn)明顯的地理區(qū)域分布。

AV1編碼雙生病毒的外殼蛋白，其序列一般是保守的。在用DNA-A的核苷酸進(jìn)行一致性比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，DNA-A-SX01-1與SLCCNV-Hn61的一致性為99.1%，而用AV1編碼的氨基酸序列進(jìn)行一致性比對(duì)時(shí)，二者的一致性只有95.7%，在所有比較序列中一致性是最低的。進(jìn)一步分析DNA-A-SX01-1和SLCCNV-Hn61的核苷酸和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)DNA-A-SX01-1的AV1第740 nt存在一個(gè)堿基的缺失導(dǎo)致了密碼子的移碼，使AV1的第247位脯氨酸變成了精氨酸，同時(shí)也使后面的氨基酸發(fā)生了變化，最終使終止密碼子的出現(xiàn)延后。這些變化使DNA-A-SX01-1與SLCCNV-Hn61的AV1之間的氨基酸一致性相對(duì)較低。

SLCCNV可以危害多種葫蘆科作物，造成植株矮化和曲葉［8］。SLCCNV可以通過(guò)煙粉虱傳播，因此在煙粉虱高發(fā)的季節(jié)，SLCCNV造成的病害可能會(huì)更嚴(yán)重，可以采用治蟲防病的方法來(lái)防控病害的發(fā)生［19］。我國(guó)地緣遼闊，蔬菜種類眾多，SLCCNV除了侵染南瓜外，還侵染甜瓜、西葫蘆、冬瓜等葫蘆科作物［8，10，20］，甚至在多年生茄科雜草上也有發(fā)現(xiàn)［21］，說(shuō)明SLCCNV的宿主范圍較大，需要加強(qiáng)作物SLCCNV的檢測(cè)來(lái)應(yīng)對(duì)其潛在的威脅，阻止病毒的傳播擴(kuò)散。

參考文獻(xiàn)

［1］?FIALLO-OLIV E， LETT J M， MARTIN D P， et al. ICTV virus taxonomy profile： Geminiviridae 2021 ［J/OL］. Journal of General Virology， 2021， 102（12）： 001696. DOI： 10.1099/jgv.0.001696.

［2］?ZERBINI F M， BRIDDON R W， IDRIS A， et al. ICTV virus taxonomy profile： Geminiviridae ［J］. Journal of General Virology， 2017， 98（2）： 131-133.

［3］?FONDONG V N. Geminivirus protein structure and function ［J］. Molecular Plant Pathology， 2013， 14（6）： 635-649.

［4］?史玉滋， 馬瑋， 孫廷珍， 等. 籽用南瓜育種研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)蔬菜， 2019（8）： 13-20.

［5］?陳利達(dá)， 曹金強(qiáng)， 石延霞， 等. 北京地區(qū)南瓜病毒病病原種類鑒定［J］. 中國(guó)蔬菜， 2018（6）： 43-47.

［6］?洪益國(guó)， 蔡健和， 王小鳳， 等. 中國(guó)南瓜曲葉病毒： 一個(gè)雙生病毒新種 ［J］. 中國(guó)科學(xué)（B輯）， 1994， 24（6）： 608-613.

［7］?XIE Yan， ZHOU Xueping. Molecular characterization of squash leaf curl Yunnan virus， a new begomovirus and evidence for recombination ［J］. Archives of Virology， 2003， 148（10）： 2047-2054.

［8］?WU Huijie， LI Meng， HONG Ni， et al. Molecular and biological characterization of melon-infecting squash leaf curl China virus in China ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2020， 19（2）： 570-577.

［9］?KON T， DOLORES L M， BAJET N B， et al. Characterization of a strain of squash leaf curl China virus from the Philippines ［J］. Journal of Phytopathology， 2003， 151（10）： 535-539.

［10］SARITHA R K， BAG T K， LOGANATHAN M， et al. First report of squash leaf curl china virus causing mosaic symptoms on summer squash （cucurbita pepo） grown in Varanasi district of India ［J］. Archives of Phytopathology and Plant Protection， 2011， 44（2）： 179-185.

［11］班一云， 丁波， 周雪平， 等. 湖南省番茄和牽?；ㄉ想p生病毒的分子鑒定［J］. 植物保護(hù)， 2017， 43（4）： 134-138.

［12］MUHIRE B M， VARSANI A， MARTIN D P. SDT： a virus classification tool based on pairwise sequence alignment and identity calculation ［J/OL］. PLoS ONE， 2014， 9（9）： e108277. DOI： 10.1371/journal.pone.0108277.

［13］KUMAR S， STECHER G， TAMURA K. MEGA 7： Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets ［J］. Molecular Biology and Evolution， 2016， 33（7）： 1870-1874.

［14］ZERBINO D R， BIRNEY E. Velvet： algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs ［J］. Genome Research， 2008， 18（5）： 821-829.

［15］SAWANGJIT S. The complete nucleotide sequence of squash leaf curl China virus-［wax gourd］and its phylogenetic relationship to other geminiviruses ［J］. ScienceAsia， 2009， 35（2）： 131-136.

［16］TAHIR M， HAIDER M S， BRIDDON R W. First report of squash leaf curl China virus in Pakistan ［J］. Australasian Plant Disease， 2010， 5（1）： 21-24.

［17］張麗， 湯亞飛， 李正剛， 等. 侵染廣東省葫蘆科作物的中國(guó)南瓜曲葉病毒的分子特征［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021， 54（19）： 4097-4109.

［18］FAUQUET C M， BRIDDON R W， BROWN J K， et al. Geminivirus strain demarcation and nomenclature ［J］. Archives of Virology， 2008， 153（4）： 783-821.

［19］POLSTON J E， BARRO P D， BOYKIN L M. Transmission specificities of plant viruses with the newly identified species of the Bemisia tabaci species complex ［J］. Pest Management Science， 2014， 70（10）： 1547-1552.

［20］MOHAMMED RIYAZ S U， DEEPAN S， DHARANIVASAN G， et al. First report on a variant of squash leaf curl China virus （SLCCNV） infecting Benincasa hispida in India ［J/OL］. New Disease Reports， 2013， 28： 20. DOI： 10.5197/j.2044-0588.2013.028.020.

［21］趙麗玲， 鐘靜， 施章吉， 等. 復(fù)合侵染水茄的兩種菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組結(jié)構(gòu)特征分析［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2020， 47（2）： 355-364.

（責(zé)任編輯：楊明麗）