燕江雪?丁霞?焦瓊杰?黃莉?曹囡囡?董信芳?倪倩

【摘要】目的 研究兒童重癥肺炎支原體肺炎（SMPP）中Toll樣受體7（TLR7）、TLR9和Ⅰ型IFN的變化及意義。方法 納入80例肺炎支原體肺炎（MPP）患兒，分為非重癥MPP組（MPP組）和重癥MPP組（SMPP組）；選擇同期于門診體檢的26名健康兒童為健康對照組。收集各組兒童血清，并收集SMPP組影像學檢查僅表現(xiàn)為單側肺實變、肺不張、肺膿腫或肺組織壞死的26例患兒患側和對側肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA檢測血清及BALF中TLR7、TLR9、髓樣分化因子88（MyD88）、IFN-α、IFN-β的含量。結果 與健康對照組相比，SMPP組和MPP組血清中TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β水平均升高，且SMPP組血清中各因子的水平均高于MPP組（P均< 0.05）?；紓菳ALF中TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β的水平均高于對側（P均< 0.01）。TLR7和MyD88水平預測SMPP的受試者操作特征曲線的曲線下面積分別為0.709、0.723。結論 過度誘導和生成的TLR7、TLR9、IFN-α和IFN-β可能是兒童SMPP發(fā)生及局部肺組織嚴重損傷的致病因素。TLR7、MyD88可以作為SMPP的預測指標以指導臨床治療。

【關鍵詞】兒童；重癥肺炎支原體肺炎；Toll樣受體7；Toll樣受體9；干擾素-α；干擾素-β

Changes and significance of TLR7/9 and IFN-Ⅰ levels in children with severe mycoplasma pneumoniae pneumonia Yan Jiangxue△， Ding Xia， Jiao Qiongjie， Huang Li， Cao Nannan， Dong Xinfang， Ni Qian.△Pediatric Respiratory Department， Lanzhou University Second Hospital， Lanzhou 730030， China

Corresponding author， Ni Qian， E-mail： natelieniqian@yeah.net

【Abstract】Objective To investigate the changes and significance of Toll-like receptor 7 （TLR7）， TLR9 and type I interferon （IFN-Ⅰ） in children with severe mycoplasma pneumoniae pneumonia （SMPP）. Methods 80 children with mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP） were divided into the non-severe MPP （MPP group） and SMPP groups （SMPP group）. 26 healthy children who underwent outpatient physical examination were chosen as the control group. Serum samples in each group were collected. In the SMPP group， bronchoalveolar lavage fluid （BALF） on the affected and contralateral sides of 26 children with unilateral lung consolidation， atelectasis， lung abscess or lung tissue necrosis on imaging examination were collected. The levels of TLR7， TLR9， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， interferon-α （IFN-α） and IFN-β in the serum and BALF samples were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The serum levels of TLR7， TLR9， MyD88， IFN-α and IFN-β in the SMPP and MPP groups were significantly higher than those in the control group， and the levels of all cytokines in the SMPP group were significantly higher compared with those in the MPP group （all P < 0.05）. The levels of TLR7， TLR9， MyD88， IFN-α and IFN-β in the BALF on the affected side were significantly higher than those on the contralateral side （all P < 0.01）. The area under the receiver operating characteristic curve （AUC） of serum TLR7 and MyD88 levels for predicting SMPP was 0.709 and 0.723. Conclusions Over-induced and generated TLR7， TLR9， IFN-α and IFN-β may be pathogenic factors for the incidence of SMPP and severe local lung tissue injury in children with SMPP. TLR7 and MyD88 can be used as predictors of SMPP to guide clinical treatment.

【Key words】Children； Severe mycoplasma pneumoniae pneumonia； Toll-like receptor 7； Toll-like receptor 9；

Interferon-α； Interferon-β

肺炎支原體肺炎（MPP）是兒科呼吸系統(tǒng)的常見疾病，所有年齡段的兒童均易感，而部分重癥MPP（SMPP）患兒會發(fā)生呼吸衰竭或肺外組織損傷，甚至留下后遺癥［1-2］。因此，尋找SMPP的早期預測指標和新的治療靶點成為提高臨床治愈率、改善預后的關鍵。現(xiàn)有研究認為，免疫調節(jié)紊亂在SMPP發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用［1， 3］。Toll樣受體7（TLR7）和TLR9是先天性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體，兩者被激活后可活化髓樣分化因子88（MyD88）途徑，產生大量細胞因子，如IFN、TNF-α、IL-6、IL-12等，進一步誘導適應性免疫的發(fā)生［4-6］。IFN-α和IFN-β是Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）家族的主要成員，具有抗病毒及免疫調節(jié)功能，而TLR7、TLR9/MyD88/IFN-Ⅰ信號通路是生成IFN-Ⅰ的主要通路［4， 7］。有報道當負反饋調節(jié)失衡時，TLR過度激活，生成大量炎癥因子，進一步導致機體產生慢性感染、自身免疫紊亂等疾?。?］。目前國內外罕見TLR7、TLR9和IFN-Ⅰ對兒童SMPP影響的相關研究。本研究通過檢測MPP患兒、SMPP患兒和健康兒童的血清，以及影像學檢查表現(xiàn)為單側肺組織病變的SMPP組患兒患側及對側肺泡灌洗液（BALF）中TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β的含量，探討兒童SMPP中TLR7、TLR9、 IFN-Ⅰ的變化和意義，為尋找SMPP的治療靶點及預測指標提供臨床依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2020年10月至2021年10月本院收治的符合MPP或SMPP診斷標準80例患兒；其中MPP患兒45例，均收集血清；SMPP患兒35例，均收集血清，且選取26例影像學檢查僅表現(xiàn)為單側肺組織病變的患兒，收集患側和對側的BALF。根據(jù)MPP患兒入院后的病情進展，將80例患兒分為非重癥MPP組（MPP組）和SMPP組。另選擇同期于本院門診體檢的26名健康兒童為健康對照組。3組患兒的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：2020A-207），征得入組兒童監(jiān)護人知情并簽署知情同意書。

二、診斷標準

參考《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》及《諸福棠實用兒科學》（2002年）中的MPP診斷標準：①具有肺炎的臨床表現(xiàn)或影像學表現(xiàn)；②確定肺炎支原體（MP）感染的病原學證據(jù)；③青霉素、頭孢類抗菌藥物治療無效。

SMPP診斷標準：除符合MPP的診斷標準外需滿足以下任一標準：①一般狀況差，有拒食或脫水征；②意識障礙；③肺部浸潤呈現(xiàn)多肺葉的受累或≥2/3的一側肺；④呼吸頻率顯著增快、發(fā)紺、呼吸困難甚至呼吸衰竭；⑤胸腔積液、肺不張、肺膿腫、壞死性肺炎、肺栓塞等肺內并發(fā)癥；⑥脈搏血氧飽和度≤92%；⑦心率明顯增快，甚至心力衰竭；⑧膿毒血癥，甚至感染性休克。

三、納入及排除標準

MPP組及SMPP組患兒的納入標準：①0～14歲，符合MPP及SMPP診斷標準；②病程在14 d以內；③血培養(yǎng)和（或）痰培養(yǎng)陰性、無明確病毒感染證據(jù)者；④入組前未使用過糖皮質激素和IFN治療。健康對照組的納入標準：0～14歲、入組前1個月內無感染史的健康兒童。

排除標準：①既往有支氣管哮喘和慢性肺病等病史的患兒；②既往有血液系統(tǒng)疾病、嚴重先天性心臟病、嚴重肝腎功能不全、先天性支氣管肺發(fā)育不良、遺傳代謝性疾病、免疫缺陷疾病等具有嚴重基礎疾病的患兒。

收集BALF的SMPP患兒納入標準：符合上述SMPP納入及排除標準，但是肺部CT僅存在單側肺部影像學改變，如單側肺不張、肺實變、肺膿腫、肺組織壞死等。

四、研究方法

1.標本采集

患兒入院后次日清晨采集空腹靜脈血2 mL，對照組健康兒童清晨采集空腹靜脈血2 mL，在4℃以3000轉/分離心10 min后，分離血清于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

2. BALF采集

按照文獻［8］技術要求，根據(jù)先對側后患側的原則行支氣管肺泡灌洗，并收集BALF各5 mL；對側選擇右肺中葉或左上葉舌段，患側選擇病變段，總回收率≥30%，紅細胞< 20%，且無大氣道分泌物混入為合格標本；將新鮮BALF移取至15 mL

錐形離心管中，在相同條件下離心后，分離上清液置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

3.標本檢測

采用ELISA檢測血清及BALF中TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β的含量，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，檢測儀器為賽默飛世爾Mulltiskan FC型酶標儀。

五、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用頻數(shù)或百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以? 表示。血清樣本數(shù)據(jù)若方差齊，通過單因素方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較采用Tukey-Kramer檢驗；若方差不齊，通過Brown-Forsythe檢驗進行多組間比較，組間兩兩比較采用Tamhanes T2檢驗。同一SMPP患兒患側及對側BALF的樣本數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗。采用Pearson相關分析檢驗血清中各因子之間的相關性。繪制受試者操作特征（ROC）曲線得到曲線下面積（AUC），分析血清中各因子水平在SMPP預測中的價值。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、3組血清TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β水平的比較

與健康對照組相比，SMPP組和MPP組血清TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β的水平均有所升高（P均< 0.05），且SMPP組的上述指標水平均高于MPP組（P均< 0.05）。見表2。

二、3組血清TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α和IFN-β的相關性分析

血清TLR7或TLR9與MyD88、IFN-α、IFN-β均呈正相關，MyD88與IFN-α、IFN-β也呈正相關（P均< 0.05）。見表3。

三、SMPP組患兒患側、對側BALF中的各因子水平比較

患側BALF中的TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β水平均高于對側（P均< 0.01）。見表4。

四、血清TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β

對SMPP的預測價值

TLR7和MyD88的AUC分別為0.709、0.723，其AUC均> 0.700，對SMPP的輔助診斷具有一定價值；TLR7的約登指數(shù)最大值為0.397，此時的截斷值為7.08 μg/L，靈敏度為68.57%，特異度為71.11%；MyD88的約登指數(shù)最大值為0.390，此時的截斷值為13.61 μg/L，靈敏度為85.71%，特異度為53.33%。見圖1、表5。

討論

MP在感染機體后，可通過特殊的細胞器黏附于宿主呼吸道上皮細胞表面生長繁殖，產生過氧化物、毒素等毒性代謝產物，造成宿主細胞損傷，并進一步激活先天性免疫系統(tǒng)，釋放細胞因子，觸發(fā)趨化及細胞毒作用；也可通過其頂端結構侵入組織細胞后合成DNA而生長繁殖，導致慢性感染［9-10］。

TLR7和TLR9主要表達于漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）的內體表面，分別識別病毒RNA或細菌DNA；當病原體入侵機體時，炎癥部位產生的趨化因子可趨化pDC至炎癥部位，此時病原體可通過受體介導的內吞作用進入pDC的內體溶酶體系統(tǒng)，同時TLR7和TLR9從內質網(wǎng)沿分泌途徑也進入內體溶酶體系統(tǒng)，進一步啟動MyD88依賴信號通路，引導IFN調節(jié)因子7向細胞核易位，進而促進細胞合成IFN-Ⅰ，生成的IFN-Ⅰ可與Ⅰ型IFN受體結合，啟動多個信號轉導通路，調控多種免疫細胞的功能，如1型輔助性T淋巴細胞（Th1）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）、自然殺傷細胞（NK）等，并釋放TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IFN-γ 等細胞因子［8，11-14］。

TLR信號轉導及后續(xù)的功能必須受到嚴格的負調控，以控制過度的炎癥反應，減輕宿主的組織損傷；大多數(shù)負調控因子的表達可由TLR的激活引起，并以負反饋的方式終止TLR的功能［15］。但是，當負反饋調節(jié)失衡時，TLR通路的過度激活導致機體產生慢性感染、自身免疫紊亂等相關疾?。?， 15］。例如在SLE中，TLR7促進患者的pDC分泌大量IFN-α，這是SLE組織損傷的重要機制［14］。流行性感冒病毒感染后可激活TLR7，通過MyD88依賴途徑，誘導大量IFN-α生成，發(fā)揮抗病毒及免疫調節(jié)作用，但當負反饋調節(jié)失衡時，IFN-α可通過誘導TNF-α、C-X-C基序趨化因子10 （CXCL10）等促炎及趨化因子的不當表達，過度活化并募集中性粒細胞，導致免疫調節(jié)紊亂，造成急性肺損傷［16］。

本研究顯示，MPP組和SMPP組血清TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α、IFN-β的水平均比對照組升高，且SMPP組患兒上述各因子的水平均高于MPP組。此外，本研究檢測了影像學檢查僅表現(xiàn)為單側肺組織病變的SMPP患兒患側和對側BALF

中TLR7、TLR9、MyD88、IFN-α和IFN-β水平，結

果顯示患側各因子水平均高于對側。上述結果表明MP感染機體后會促進TLR7、TLR9的誘導和IFN-α、IFN-β的生成，且SMPP患兒外周血中和損傷肺組織局部TLR7、TLR9、IFN-α、IFN-β水平更高，說明過度活化的TLR7、TLR9和過度生成的IFN-α、IFN-β很有可能是SMPP的致病因素。尋找可以應用于臨床的TLR7、TLR9抑制劑，有可能成為治療SMPP的新方法。Yang等［17］發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，IFN-α2水平在輕癥MPP患兒BALF中并無升高，但在SMPP患兒BALF中升高，與本研究一致。另有學者報道，新型冠狀病毒感染引起的重癥肺炎血管并發(fā)癥，依賴于血管緊張素轉換酶2（ACE2）的表達，而IFN-α或IFN-β可促進ACE2的表達，并且IFN-α對內皮細胞血管形成、穩(wěn)態(tài)和屏障功能可產生不利影響［18］。過度表達的IFN-α、IFN-β和ACE2是否參與了SMPP的肺血管損傷機制，有待進一步研究。

本研究中血清各因子的相關性分析顯示，血清TLR7或TLR9與MyD88、IFN-α、IFN-β水平之間均呈正相關。綜合以上結果，推測TLR7、TLR9/MyD88/IFN-Ⅰ信號通路可能是SMPP致病信號通路，該信號通路的過度活化很有可能是SMPP患兒局部肺組織急性損傷的致病機制。由于本研究為臨床試驗，相較于動物實驗而言，具有一定局限性，如不能嚴格控制發(fā)病時間來觀察上述因子的動態(tài)變化等，所以仍需進一步的研究來證實該信號通路在SMPP發(fā)病中的意義。

ROC曲線分析顯示，TLR7、MyD88的AUC >

0.700，對SMPP具有一定的預測價值，其中以MyD88為診斷指標時的AUC最大、靈敏度較高。IFN-α和IFN-β的AUC分別為0.666、0.694，十分接近0.700，筆者推測在后續(xù)加大研究的樣本量后，IFN-α和IFN-β也可能是預測SMPP的輔助指標。

綜上所述，過度誘導和生成的TLR7、TLR9、IFN-α和IFN-β可能是兒童SMPP發(fā)生及SMPP肺組織嚴重損傷的致病因素之一。TLR7、MyD88可以作為SMPP的預測指標輔助指導臨床治療。未來通過研究和使用TLR7、TLR9的拮抗劑來抑制其誘導活化，有可能減輕SMPP患兒的病情，阻止急性肺損傷。由于本研究納入的病例數(shù)較少，加之臨床研究有其局限性，后續(xù)研究將繼續(xù)加大樣本量，并進一步完善TLR7、TLR9/MyD88/IFN-Ⅰ信號通路與SMPP致病機制相關研究，為SMPP的診治提供更為充分的依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-06-10）

（本文編輯：林燕薇）