饒宛婷 申宜昊 陶秀紅 邢晉放

實(shí)時(shí)剪切波超聲彈性成像（real time shear wave elastography， RT-SWE）技術(shù)是一項(xiàng)新型超聲彈性成像技術(shù)，具有無(wú)創(chuàng)、定量、操作簡(jiǎn)便和重復(fù)性高的特點(diǎn)［1］。RT-SWE 的基本原理是通過(guò)捕獲被測(cè)組織產(chǎn)生的橫向剪切波，生成反映組織彈性特征的二維分布圖并實(shí)時(shí)成像；通過(guò)測(cè)定橫向剪切波在感興趣區(qū)（region of interest， ROI）內(nèi)的傳播速度（shear wave velocity， SWV），推算出剪切波彈性量化測(cè)值（shear wave elastic quantitative measurement， SWQ）［2-3］。由于橫向剪切波所經(jīng)過(guò)的組織成分及其含量直接決定SWV 的大小，因此，SWQ 與探查組織的成分及其含量存在密切關(guān)系。

膠原纖維是陰莖組織中最主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，約占40%～65%，在維持陰莖勃起過(guò)程中發(fā)揮著主要作用［4］。大鼠陰莖組織中包含的膠原纖維類型有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型，其中以Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維為主［5］。Ⅲ型膠原纖維是參與陰莖拉伸過(guò)程的基本組織成分，且參與組織損傷的修復(fù)過(guò)程［6］，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維的含量具有重要臨床意義。目前，臨床尚無(wú)定量評(píng)價(jià)Ⅲ型膠原纖維含量的無(wú)創(chuàng)方法。根據(jù)RT-SWE基本原理進(jìn)行理論分析：Ⅲ型膠原纖維作為陰莖組織內(nèi)的主要成分，其含量與SWQ存在相關(guān)性。故本研究旨在通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陰莖組織SWQ與Ⅲ型膠原纖維的含量是否存在相關(guān)性，為利用RTSWE定量評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)膠原纖維含量奠定必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

方 法

1.主要試劑

5%戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；Anti-Collagen Ⅲ（美國(guó)Abcam 公司，No.ab6310）；即用型MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒（上海邁新生物技術(shù)有限公司）；檸檬酸組織抗原緩沖液（上海邁新生物技術(shù)有限公司）；蘇木精染液（上海邁新生物技術(shù)有限公司）；伊紅染液（上海邁新生物技術(shù)有限公司）；甲醛液（上海信帆生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；H2O2（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）。

2.成像儀器

Aixplorer 超聲診斷儀（美國(guó)HOLOGIC 公司）；探頭型號(hào)為SL 15-4（美國(guó)HOLOGIC公司）。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只清潔級(jí)雄性SD大鼠，5～60周齡，體重110～450 g，由復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和籠養(yǎng)。大鼠均在相同室溫、相對(duì)濕度環(huán)境下同步飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)操作符合復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的要求。

4.RT-SWE檢查

大鼠稱重，戊巴比妥鈉（劑量30 mg/kg）腹腔注射麻醉。待大鼠翻正反射消失后，取仰臥位，固定頭部和四肢，以充分暴露大鼠陰莖。所有大鼠的RTSWE 檢查均由同一高年資超聲醫(yī)師完成。取大鼠陰莖橫切面進(jìn)行灰階超聲掃查，待陰莖組織的解剖圖像顯示清晰后，將成像模式切換至SWE，主要儀器設(shè)置“圖像優(yōu)化”調(diào)節(jié)為“Pen”，調(diào)整取樣框的大小使其大于陰莖橫切面；選擇陰莖中部的橫切面進(jìn)行RTSWE檢查，在圖像質(zhì)量最佳時(shí)連續(xù)存儲(chǔ)圖像30 s。

5.SWQ測(cè)量

回放圖像，選取陰莖組織內(nèi)色彩充填完整、穩(wěn)定且無(wú)馬賽克樣干擾斑點(diǎn)的RT-SWE 圖像進(jìn)行SWQ 測(cè)量。將圓形ROI放置于陰莖組織內(nèi)，調(diào)整其直徑使最大范圍包繞陰莖且邊緣不超過(guò)陰莖包膜。測(cè)量ROI內(nèi)大鼠陰莖組織SWQ的均值“Mean”，單位選擇kPa。

6.免疫組化分析

完成RT-SWE檢查后即刻對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，從陰莖根部剪斷陰莖組織并將其置于4%中性甲醛液中固定24 h。取出固定液中陰莖組織，擦干后置無(wú)水乙醇中30 min 進(jìn)行脫水處理；隨后將其放入石蠟中進(jìn)行包埋，并制成5 μm切片，于45℃恒溫箱中烘干后，使用二甲苯和無(wú)水乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理。向修復(fù)盒中滴加檸檬酸組織抗原緩沖液（pH 6.0），并將切片放入修復(fù)盒中，于95℃微波輻射10 min。待修復(fù)液冷卻至室溫后，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）漂洗3 次，每次5 min，以修復(fù)抗原。滴加3% H2O2于室溫下孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加Anti-Collagen Ⅲ（1∶50）一抗稀釋緩沖液，并放入4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，次日使用PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加即用型MaxVisionTM試劑于室溫條件孵育15 min，使用PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺于室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，分級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明后封片。

光鏡下（×200倍）觀察每張切片，隨機(jī)選擇3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞均勻的視野，分析組織切片中Ⅲ型膠原纖維的陽(yáng)性面積百分比（positive area percentage， PAP），并計(jì)算其平均值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)分析SWQ 和PAP 是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則以中位數(shù)（四分位間距）表示。根據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)的結(jié)果選擇Pearson 或Spearman 秩和檢驗(yàn)分析SWQ 與PAP 間的相關(guān)性。雙側(cè)P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.RT-SWE檢查

成功完成20 只大鼠陰莖組織的RT-SWE 檢查和SWQ 測(cè)量，所有大鼠的RT-SWE 圖像質(zhì)量均符合SWQ 的測(cè)量要求。大鼠陰莖組織橫切面RT-SWE 圖像特征（圖1）：灰階圖像顯示陰莖橫切面呈圓形，邊界清晰，包膜完整，內(nèi)部為均勻低回聲；RT-SWE圖像顯示陰莖組織內(nèi)色彩充填完整且無(wú)馬賽克樣干擾斑點(diǎn)；SWQ 測(cè)量結(jié)果包括最大值、最小值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。所有大鼠陰莖組織SWQ的Mean測(cè)值范圍為5.80～11.10 kPa，平均值為（8.83±1.53）kPa。

圖1 大鼠陰莖RT-SWE圖像

2.膠原纖維的免疫組化分析

大鼠陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)情況如圖2所示：切片內(nèi)的棕色區(qū)域代表陽(yáng)性（Ⅲ型膠原纖維）。所有大鼠陰莖中部組織PAP 的中位數(shù)（四分位間距）為6.5%（16.3%），測(cè)值范圍為1.2%～29.6%。

圖2 大鼠陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)情況（×200）

圖3 大鼠陰莖組織SWQ與PAP的相關(guān)性

3.SWQ與PAP的相關(guān)性分析

單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)結(jié)果：大鼠陰莖組織的SWQ 符合正態(tài)分布（P=0.200＞0.05），而PAP 不 符 合 正 態(tài) 分 布（P=0.008＜0.01）。故 選 擇Spearman 秩和檢驗(yàn)對(duì)SWQ 與PAP 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：SWQ 與PAP 顯著相關(guān)（P＜0.001），相關(guān)系數(shù)r為-0.771（圖3）。

討 論

RT-SWE 是一項(xiàng)新型無(wú)創(chuàng)超聲檢查技術(shù)，能夠客觀、定量顯示組織的彈性特征，重復(fù)性高且操作簡(jiǎn)便［1］。RT-SWE 成像的基本原理為：探頭發(fā)射的聲輻射力脈沖在被測(cè)組織不同深度上連續(xù)聚焦，可使被測(cè)組織受到機(jī)械激勵(lì)以產(chǎn)生橫向剪切波。RT-SWE 超聲系統(tǒng)通過(guò)探頭快速捕獲被測(cè)組織產(chǎn)生的橫向剪切波，將其進(jìn)行編碼處理后轉(zhuǎn)換為可反映組織彈性特征的二維分布圖并實(shí)時(shí)成像；通過(guò)精確測(cè)量ROI內(nèi)橫向剪切波的SWV（m/s），根據(jù)公式E=3ρcs2（E 為SWQ，ρ為組織密度，cs為SWV），可推算出反映剪切波所經(jīng)過(guò)組織彈性特征的客觀指標(biāo)——SWQ（kPa）［2-3］。故橫向剪切波所經(jīng)過(guò)的組織，其成分和含量的改變可直接影響SWQ 的大小，并通過(guò)RT-SWE 進(jìn)行客觀定量顯示。

膠原纖維是陰莖組織中最主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，約占40%～65%，在維持陰莖的正常勃起過(guò)程中具有重要的作用［4］：膠原纖維的纖維支架樣結(jié)構(gòu)能夠防止陰莖在勃起過(guò)程中出現(xiàn)變形、彎曲，保證陰莖的正常勃起［5］；能夠防止基底膜和平滑肌細(xì)胞過(guò)度拉伸，避免內(nèi)皮細(xì)胞及其下細(xì)胞層在勃起過(guò)程中出現(xiàn)破裂［7］；纖維鞘結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)陰莖內(nèi)的血管和神經(jīng)，避免在勃起過(guò)程中出現(xiàn)動(dòng)脈塌陷和神經(jīng)受壓［8］。研究證明，衰老、高血壓、糖尿病、睪酮缺乏、陰莖損傷（例如過(guò)度摩擦）等因素均會(huì)導(dǎo)致陰莖組織內(nèi)膠原纖維的含量發(fā)生變化，最終導(dǎo)致勃起功能障礙（erection dysfunction， ED）［9-11］。

大鼠陰莖組織中含有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型等多種類型的膠原纖維，以Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維為主［5］。其中，Ⅲ型膠原纖維具有較高的順應(yīng)性，是參與陰莖拉伸過(guò)程的基本組織成分［6］。此外，Ⅲ型膠原纖維主要參與組織損傷的早期修復(fù)過(guò)程：在損傷刺激下，成纖維細(xì)胞增多，部分轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成Ⅲ型膠原纖維，以促進(jìn)瘢痕愈合，提高抗撕裂強(qiáng)度［12］。Ⅲ型膠原纖維含量的過(guò)度增加會(huì)引起纖維斑塊的攣縮和陰莖的勃起畸形，是陰莖組織纖維化病變的主要特征，故準(zhǔn)確評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維的含量具有重要的臨床意義。

目前，組織活檢技術(shù)仍是臨床上可定量分析陰莖組織成分的唯一方法。然而此方法具有創(chuàng)傷性，且對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，患者在活檢術(shù)后易出現(xiàn)陰莖血腫、硬結(jié)和疼痛等并發(fā)癥；此外，由于該器官具有私密性和功能保護(hù)的特殊性，陰莖組織活檢技術(shù)臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限。而常規(guī)灰階超聲檢查主要顯示陰莖組織病變的形態(tài)學(xué)變化，無(wú)法評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維的含量。初步研究發(fā)現(xiàn)，RT-SWE 技術(shù)可用于陰莖海綿體硬度的評(píng)價(jià)、動(dòng)脈性ED 和非動(dòng)脈性ED 的鑒別以及陰莖硬結(jié)癥的診斷［13-15］。由于Ⅲ型膠原纖維含量的變化能夠影響陰莖組織的彈性特征，據(jù)此，作者推測(cè)陰莖組織SWQ 與Ⅲ型膠原纖維含量具有相關(guān)性。

本研究通過(guò)免疫組化方法測(cè)得Ⅲ型膠原纖維的PAP，并與RT-SWE 所測(cè)得的SWQ 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者有顯著相關(guān)性（r=-0.771，P＜0.001）。這一研究結(jié)果提示，陰莖組織內(nèi)的膠原纖維是影響SWQ 的主要成分，通過(guò)測(cè)量陰莖組織的SWQ 可以定量分析陰莖組織內(nèi)的Ⅲ型膠原纖維含量。

綜上所述，陰莖組織的SWQ 與Ⅲ型膠原纖維具有相關(guān)性，可作為定量評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)Ⅲ型膠原纖維含量的客觀指標(biāo)，因此RT-SWE有望成為一種定量評(píng)價(jià)陰莖組織膠原纖維含量的無(wú)創(chuàng)新方法，有益于提高臨床診斷陰莖組織病變的精確度，值得深入探討與研究。