杜 森 周 青 孫亮亮 劉 利 鮑志國

膽囊癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其起病隱匿、臨床癥狀不典型，與膽囊炎難以區(qū)分，早期難以確診，多數(shù)膽囊癌患者確診時已錯失手術(shù)最佳時機，影響預(yù)后［1］。因此，及早診斷膽囊癌對控制膽囊癌患者病情，延長患者生存時間尤為重要。多層螺旋CT（multi-slice spiral CT， MSCT）是診斷膽囊癌的重要手段，但有些膽囊癌患者的CT 征象并不突出，且螺旋CT 受炎癥影響，從而影響膽囊癌的確診率［2］。有關(guān)研究表明，影像學與血清指標聯(lián)合可提高診斷膽囊癌的準確性［3］。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， LncRNA）在膽囊癌中異常表達，提示其可作為診斷膽囊癌的生物學指標［4］。LncRNA 尿 路 上 皮 癌 胚 抗 原1 （LncRNA urothelial carcinoembryonic antigen 1， LncRNA UCA1）是LncRNA 的一員，其在膽囊癌中表達上調(diào)，與患者預(yù)后相關(guān)，LncRNA UCA1 可能在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中起促進作用［5］。基于上述研究，本文通過檢測LncRNA UCA1 在膽囊癌患者中的表達水平，旨在探究MSCT 聯(lián)合血清LncRNA UCA1 檢測是否可有效鑒別膽囊癌患者，為臨床早期診斷膽囊癌提供參考。

方 法

1.臨床資料

選取2018年2月—2022年3月本院收治的膽囊癌患者74 例為膽囊癌組，男30 例，女44 例；年齡41～70 歲，平均年齡（55.64±11.33）歲。另選取同期診治的慢性膽囊炎患者74 例為膽囊良性疾病組，男35例，女39 例；年齡41～70 歲，平均年齡（54.27±11.08）歲。膽囊癌組、膽囊良性疾病組年齡、男/女相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。納入標準：①膽囊癌患者符合《膽囊癌診斷和治療指南（2015版）》［6］中的診斷標準；②受試者經(jīng)病理檢查確診為慢性膽囊炎、膽囊癌；③遵從《赫爾辛基宣言》中相關(guān)要求；④受試者檢查資料均齊全；⑤受試者均無放化療史。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤者；②伴有嚴重肝腎功能障礙者；③處于妊娠/哺乳期者。

2.血樣收集

收集受試者行MSCT 檢查前外周血5～6 mL，靜置30 min，4℃條件下，以4 800 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，分離血清后分裝，-70 ℃保存。

3.MSCT檢查

利用寶石CT 掃描儀（Discovery HD750，GE 公司）對所有受試者進行MSCT檢查。受試者檢查前禁食8～12 h，在檢查前1 h 囑咐受試者飲800 mL 溫水，檢測時受試者再飲500 mL 溫水使膀胱、胃十二指腸充盈。受試者取平臥位，先平掃膈頂至胰腺平面，后進行增強掃描，經(jīng)肘靜脈注射碘海醇對比劑（注射劑量為1.5 mL/kg，注射速率為3.2～3.5 mL/s），由2名放射科醫(yī)師對受試者進行MSCT 掃描，并判定病灶性質(zhì)；其中慢性膽囊炎：其膽囊壁規(guī)則/性彌漫性增厚，膽囊壁柔軟，增強掃描后均勻強化，膽囊黏膜線連續(xù)、完整，膽囊與肝臟等臟器有明顯的界限；而膽囊癌：其膽囊壁表現(xiàn)為不規(guī)則增厚、僵硬，膽囊形態(tài)不規(guī)則，動脈期膽囊黏膜有顯著強化，有時可出現(xiàn)周圍組織受侵襲的征象。病灶圖像判定標準如下：

（1）膽道梗阻：其中低位梗阻是膽總管下端表現(xiàn)為擴張，而高位梗阻是肝門以下肝管系統(tǒng)表現(xiàn)為擴張。

（2）膽囊壁僵硬：是指囊壁表現(xiàn)為僵直，其形態(tài)不規(guī)整，喪失正常輪廓。

（3）膽囊壁增厚及增厚方式：以膽囊壁最厚處的厚度超過3 mm 為增厚；另外，以最厚處與最薄處的膽囊壁厚度比值≥2∶1 且不連續(xù)性增厚為不規(guī)則性增厚，而以比值＜2∶1且均勻性增厚為規(guī)則性增厚。

（4）侵犯肝臟：肝臟膽囊床表現(xiàn)為模糊，且肝臟內(nèi)出現(xiàn)斑片狀低密度影，在增強掃描后呈現(xiàn)片狀強化狀態(tài)。

（5）膽囊黏膜線：增強掃描時，以＞ 90%層面黏膜線中斷為黏膜線破壞/不完整，否則為完整。

4.實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）法檢測血清LncRNA UCA1 表達水平

于冰上解凍適量血清，以TRIzol LS Reagent（10296-010，Ambion 公司） 提取RNA；利用MMLV first strand cDNA Synthesis Kit （TQ2501-01，OMEGA 公司）將RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；之后， 按 SYBR Green Realtime PCR Master Mix（CAL412，北京華越洋生物科技有限公司）、qRTPCR 儀（PikoReal，Thermo Scientific 公司）說明書擴增cDNA，讀取循環(huán)閾值（CT 值）。擴增參數(shù)：98.6℃預(yù)變性6 min；96.2℃變性30 s，62.5℃退火20 s，72.5℃延 伸15 s，循 環(huán)40 次。GAPDH 是LncRNA UCA1 的內(nèi)參，其中GAPDH 上游引物序列為5’-GCTGCAGA AGGTCCGAAGAA-3’，下游引物 序 列 為5’-TTCACCACGTCCAGTTGCTT-3’；LncRNA UCA1 上 游 引 物 序 列 為 5’ -GCTGCAGAAGGTCCGAAGAA-3’，下游引物序列為 5’ - GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG - 3’。LncRNA UCA1相對表達量以2-ΔΔCT法計算。

5.血 清 癌 胚 抗 原 （carcinoembryonic antigen， CEA）、 糖 類 抗 原125 （carbohydrate antigen 125， CA125）水平檢測

常溫下解凍適量血清，按全自動化學發(fā)光免疫分析儀（I2000，美國雅培公司）說明書檢測受試者血清CEA、CA125水平，以血清CEA水平＜36.67 μg·L-1或血清CA125 水平＜88.87 U·mL-1為膽囊癌陰性。

6.聯(lián)合檢查

MSCT 檢查、血清LncRNA UCA1 檢測中若有一項或一項以上為膽囊癌陰性，則判定兩項聯(lián)合診斷膽囊癌為陰性。

7.統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用SPSS25.0 軟件分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。以例或%描述計數(shù)資料，行卡方檢驗；以±s表示計量資料，行t檢驗；以術(shù)后病理檢查結(jié)果為金標準，MSCT 檢查、血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 及MSCT 檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1診斷膽囊癌的價值以四格表分析；血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 診斷膽囊癌的價值以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估。

結(jié) 果

1.2組患者MSCT征像比較

2 組患者均呈現(xiàn)膽囊壁增厚，且膽囊癌患者膽囊壁厚度為（9.76±3.25）mm，高于膽囊良性疾病患者的（4.64±1.45）mm（t=12.376，P＜0.05）。另外，與膽囊良性疾病組相比，膽囊癌組患者膽囊壁僵硬、膽囊壁不規(guī)則增厚、侵犯肝臟、膽囊邊界不清、膽囊黏膜線不完整的占比均較高（P＜0.05）。見表1。

表1 2組MSCT征像比較（例）

2.MSCT 典型影像及MSCT 檢查對膽囊癌的診斷價值

以膽囊癌患者術(shù)后病理檢查結(jié)果為金標準，評估MSCT檢查對膽囊癌的診斷價值。74例膽囊癌患者中有7 例漏診，74 例膽囊良性疾病患者中有16 例誤診，MSCT 檢查診斷膽囊癌的靈敏度為90.54%、特異度為78.38%、準確度為84.46%。見表2。MSCT 典型影像見圖1。

表2 MSCT檢查對膽囊癌的診斷價值（例）

圖1 慢性膽囊炎及膽囊癌典型病例影像結(jié)果

表3 膽囊癌組、膽囊良性疾病組患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比較n=74，± s

表3 膽囊癌組、膽囊良性疾病組患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比較n=74，± s

組別CEA/(μg·L-1)CA125/(U·mL-1)膽囊良性疾病組膽囊癌組t值P值LncRNA UCA1 1.01±0.34 1.87±0.62 10.462＜0.001 23.63±10.74 54.04±24.56 9.759＜0.001 57.68±26.22 145.23±66.04 10.599＜0.001

表4 血清LncRNA UCA1、CEA、CA125對膽囊癌的診斷結(jié)果（例）

表5 MSCT檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1對膽囊癌的診斷結(jié)果（例）

表6 MSCT檢查、血清LncRNA UCA1、CEA、CA125單項檢測及聯(lián)合檢測的診斷效能比較

3.膽囊癌組、膽囊良性疾病組患者血清LncRNA UCA1、CEA、CA125水平比較

膽囊癌組患者血清LncRNA UCA1、 CEA、CA125 水 平 高 于 膽 囊 良 性 疾 病 組（P＜0.05）。見表3。

4.血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 水平對膽囊癌的診斷價值

血清LncRNA UCA1、CEA、CA125 診斷膽囊癌的ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）分別為 0.894 （95%CI 0.838～0.950）、 0.664 （95%CI 0.577～0.751）、0.685（95%CI 0.599～0.770），截斷值分別為1.48、36.67 μg·L-1和88.87 U·mL-1，靈敏度分別為89.19%、54.05%、55.41%，特異度分別為79.73%、56.76%、60.81%，準確度分別為84.46%、55.41%、58.11%。以血清LncRNA UCA1相對表達量＜1.48 或血清CEA 水平＜36.67 μg·L-1或血清CA125 水平＜88.87 U·mL-1為膽囊癌陰性。見圖2、表4。

5.MSCT 檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1 評估膽囊癌的價值

以術(shù)后病理檢查結(jié)果為金標準，判斷MSCT檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1 診斷膽囊癌的價值，結(jié)果顯示，MSCT 檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1 診斷膽囊癌的特異度、準確度（分別為95.95%、91.89%）明顯高于MSCT 檢查和LncRNA UCA1、CEA、CA125 單獨診斷（P＜0.05），且其靈敏度（為87.84%）較高。見表5、表6。

圖2 血清LncRNA UCA1、CEA、CA125診斷膽囊癌的ROC曲線

討 論

膽囊癌早期不易被察覺，患者確診時已處于中晚期，手術(shù)作為治療膽囊癌的主要手段，其雖可一定程度延長膽囊癌患者壽命，但多數(shù)膽囊癌患者惡性程度較高，預(yù)后并不理想［7］。且膽囊癌發(fā)生發(fā)展與血管異常生成、LncRNA 表達失調(diào)、免疫逃逸等有關(guān)［5，8］。因此，尋找與膽囊癌病理發(fā)展有關(guān)，且可早期有效診斷膽囊癌的方法，對改善膽囊癌患者生存狀態(tài)有積極意義。

MSCT 分辨率較高，其可清晰顯示膽囊內(nèi)結(jié)節(jié)、腫塊、膽囊壁增厚等征象，可較準確地鑒別診斷膽囊癌［9-10］。本研究中膽囊癌患者膽囊壁僵硬占比、膽囊壁不規(guī)則增厚占比、侵犯肝臟占比、膽囊邊界不清占比、膽囊黏膜線不完整占比較高，與張碧鋒等［9］研究結(jié)果相似，表明MSCT檢查可有利于臨床鑒別膽囊癌與慢性膽囊炎。研究發(fā)現(xiàn)，MSCT 可顯示膽管癌發(fā)生部位、范圍，其診斷膽管癌的靈敏度為91.5%，特異度為72.7%，MSCT 對膽管癌有一定診斷價值［10］；而閔鋼等［11］通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)，以膽囊癌患者術(shù)后病理證實為對照，利用MSCT檢查可正確診斷80%的膽囊癌患者。本研究顯示，MSCT 檢查診斷膽囊癌的靈敏度為90.54%、特異度為78.38%、準確度為84.46%，提示MSCT 檢查對臨床診斷膽囊癌有一定價值，術(shù)前行MSCT檢查可有益于臨床判定受試對象是否患有膽囊癌。本研究與閔鋼等［11］研究結(jié)果略有差異，可能是由于受試者個體差異、影像學醫(yī)生經(jīng)驗所造成的；另外，MSCT 檢查診斷膽囊癌的診斷準確度較低，可能是因為慢性膽囊炎疾病患者與膽囊癌的MSCT征象難以鑒別。

LncRNA 是一類可穩(wěn)定存在于血清的長鏈RNA分子，取材方便，易于檢測，其可影響血管生成，介導(dǎo)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition， EMT）過程，與肝癌、胃癌、膽囊癌等發(fā)展過程相關(guān)，且LncRNA 具有診斷多種癌癥的潛在價值［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA UCA1 在肝細胞癌中表達上調(diào)，高水平LncRNA UCA1 與肝細胞癌不良預(yù)后密切相關(guān)，LncRNA UCA1 有望成為診斷肝細胞癌、評估預(yù)后的標志物［13］；而Zhang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1 在膽囊癌中呈過表達，敲低LncRNA UCA1 表達可抑制膽囊癌進展，LncRNA UCA1 可作為膽囊癌治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，膽囊癌患者血清LncRNA UCA1 表達水平 較 高，與Zhang 等［14］研 究 趨 勢 一 致，提 示LncRNA UCA1 可能影響膽囊癌發(fā)生發(fā)展，推測LncRNA UCA1 可能通過調(diào)節(jié)膽囊癌細胞增殖、遷移等過程進而促進膽囊癌發(fā)展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA UCA1 診斷膽囊癌的AUC 為0.894，靈敏度為89.19%，特異度為79.73%，準確度為84.46%，提示檢測血清LncRNA UCA1 水平有助于臨床診斷膽囊癌，LncRNA UCA1 有望成為診斷膽囊癌的輔助指標。CEA、CA125均是糖鏈抗原，是診斷膽囊癌的傳統(tǒng)標志物［15］。本文通過比較膽囊癌組與膽囊良性疾病組患者血清CEA、CA125 水平，發(fā)現(xiàn)膽囊癌組患者血清CEA、CA125 水平較高，與張陽等［15］研究結(jié)果類似，且CEA、CA125 診斷膽囊癌的AUC 分別為0.664、0.685，診斷價值較低，且兩者診斷靈敏度、特異度均低于MSCT 檢查、血清LncRNA UCA1 單獨診斷。因此，本文通過將MSCT 檢查與血清LncRNA UCA1 進行聯(lián)合用于膽囊癌診斷，結(jié)果顯示，MSCT檢查與血清LncRNA UCA1聯(lián)合診斷膽囊癌的特異度、準確度最高（分別為95.95%、91.89%），且靈敏度為87.84%，提示MSCT 檢查、血清LncRNA UCA1 聯(lián)合可提高診斷膽囊癌的特異度，升高診斷膽囊癌的價值，MSCT 檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1 有望成為一種診斷膽囊癌的可靠、有效方法，有一定臨床參考價值。

綜上，MSCT 檢查聯(lián)合血清LncRNA UCA1 可有效提高診斷膽囊癌的價值，有助于臨床高效鑒別或診斷膽囊癌。但本研究樣本較少且未進行預(yù)后隨訪，后續(xù)將增加研究樣本數(shù)并進行遠期預(yù)后隨訪，以便增加實驗說服力。