魏禎禎,宋程威,郭麗麗,郭 琪,侯小改

(河南科技大學農(nóng)學院,河南 洛陽 471023)

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子作為乙烯信號傳導的重要調(diào)節(jié)因子家族,由高度保守的AP2/ERF DNA結構域組成,其中含有60～70個氨基酸[1-2]。近年來AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子陸續(xù)在不同植物中被鑒定出來,例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中含有147個,其中122個基因?qū)儆贓RF家族,只含有1個AP2/ERF結構域;水稻(Oryzasativasubsp.japonica)中含有139個基因[3];葡萄(Vitisvinifera)中含有149個基因,這些基因中至少含有1個AP2/ERF結構域[4];白菜(Brassicarapavar. glabra)中鑒定出291個,白菜AP2/ERF基因家族同樣分為AP2、ERF、RAV和其他4個亞族[5];甜橙(Citrussinensis)中有108個基因[6]。大量研究表明,ERF亞族基因在葉衰老、阻遏鐵的獲取、負調(diào)節(jié)植物抗鹽性等方面也發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥中AtERF4和AtERF8可以通過靶向表硫代物蛋白/表硫代物調(diào)節(jié)衰老基因和許多與衰老相關基因的表達來加速早熟葉片的衰老[7]。在小金海棠(Malusxiaojinensis)中MxERF4與MxFIT轉(zhuǎn)錄因子的蛋白相互作用,MxERF4直接與其啟動子結合抑制了鐵轉(zhuǎn)運蛋白MxIRT1的表達,利用病毒沉默抑制MxERF4基因的表達可致使MxIRT1表達量增加[8]。在蘋果(Malusdomestica)中MdERF4過表達對蘋果的耐鹽性有負調(diào)節(jié)作用,并且能夠直接抑制MdERF3的表達[9]。也有研究發(fā)現(xiàn),ERF轉(zhuǎn)錄因子與植株衰老、花瓣脫落和花期調(diào)控密切相關[10]。研究表明,擬南芥AtERF4基因前體因mRNA的多聚腺苷酸化作用而存在于兩種不同的亞型,ERF4-R含有EAR基序,起阻遏作用;而另一種形式ERF4-A缺乏這一基序,起激活作用,這兩種亞型通過調(diào)控CAT3基因的表達來調(diào)控植株的衰老進程[11]。在擬南芥中,AtERF1通過直接抑制FT基因的轉(zhuǎn)錄來延緩開花[12]。在玫瑰(Rosahybrida)中RhERF4可以調(diào)節(jié)編碼果膠代謝酶相關基因的表達,從而通過改變果膠的代謝來調(diào)節(jié)花瓣脫落。此外,RhERF4基因的表達受生長素影響,該基因表達量減少加速了花瓣的脫落,沉默RhERF4基因降低了植物離層中的果膠豐度,通過與RhBGLA1的啟動子結合,降低RhBGLA1基因的表達來達到延緩花瓣脫落的目的[13]。

牡丹(Paeonia×suffruticosa)是我國傳統(tǒng)木本名花,其栽培歷史悠久,花朵色澤艷麗且典雅華貴,深受各國人民喜愛,為我國的候選國花,具有很高的觀賞價值[14-15]。但由于牡丹自然花期短且集中,其早花和晚花品種相對較少,在產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過程中,因無法滿足人們對長觀賞期的需求,嚴重影響牡丹的觀賞產(chǎn)業(yè)價值并限制當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展。因此,研究其花期調(diào)控和花瓣衰老的分子生物學基礎,對實現(xiàn)牡丹周年開花和晚花品種選育具有重要意義。

目前,前人對延長植物觀賞周期的分子機制開展了一些研究,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)PsSVP基因超表達植株與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉大而少,植株較高且延遲開花[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)PsSOC1基因在煙草中異源表達可使植株提前開花且促進植株生長,Zhang等[18]將PsSOC1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后得到同樣的結論。但關于牡丹ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的基因分離及花期調(diào)控相關研究還較少。本研究從牡丹品種‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)3代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中,鑒定到一個與花期調(diào)控相關的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子,命名為PoERF4,并對其進行生物信息學分析,探究PoERF4基因的時空表達模式和生長素對該基因的調(diào)控作用,以期為牡丹花瓣衰老分子機理及改良牡丹的生物性狀的進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料‘鳳丹’屬于早花牡丹品種;‘鳳丹’早花突變株系是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)的‘鳳丹’的芽變品種,該品種開花時間2020年比‘鳳丹’早7 d,2021年比‘鳳丹’早9 d;‘連鶴’(P.×suffruticosa‘Lianhe’)屬于晚花牡丹品種,該品種開花時間2020年比‘鳳丹’晚16 d,2021年比‘鳳丹’晚10 d。上述3個品種均為白色系單瓣花型。

‘鳳丹’取自河南科技大學試驗基地,收集其露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期和衰敗期的花瓣、葉片、莖、花萼,以及早花‘鳳丹’突變株系和‘蓮鶴’半開期的花瓣。當‘鳳丹’達到圓桃期時,選擇長勢相近的植株用100 μmol/L生長素誘導處理,在處理后第1、2、4、8天分別取其花瓣,液氮速凍后,在超低溫-80 ℃冰箱保存樣品,用于分析生長素誘導下的基因表達模式。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

參照天根生化科技公司植物組織總RNA提取試劑盒說明書,提取‘鳳丹’不同花期(露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期)花瓣及不同組織(葉片、莖、花萼),以及‘鳳丹’早花突變體和‘蓮鶴’半開期的花瓣及生長素處理后的‘鳳丹’花瓣的總RNA,利用1%(質(zhì)量分數(shù),下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,超微量紫外分光光度計(Nano Drop one,美國)檢測總RNA的濃度。采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。

1.3 PoERF4基因的克隆

根據(jù)前期獲得的‘鳳丹’3代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的序列,通過Primer Premier 5.0設計PoERF4基因的引物(表1),以‘鳳丹’花瓣cDNA為模板,用TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase(全式金)進行擴增,50 μL反應體系:cDNA 2 μL,TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL,5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL,10 μmol/L正反向引物各1～2 μL,其余加ddH2O補齊體系。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55～58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。目的片段采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行回收,回收產(chǎn)物與pMD18-T Vector載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中進行克隆,挑選陽性單克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 PoERF4基因克隆和qRT-PCR分析引物

1.4 ‘鳳丹’PoERF4基因的生物信息學分析

通過Translate分析‘鳳丹’PoERF4基因推導的氨基酸序列,利用ProtParam、NCBI中數(shù)據(jù)庫CDD、Protscale、NetPhos和TMHHMM分別預測分析蛋白特性理化性質(zhì)、保守結構域、蛋白質(zhì)親疏水性、蛋白磷酸化位點和跨膜結構。采用SPOMA和SWISS-MODEL預測蛋白質(zhì)的二級和三級結構。

1.5 ‘鳳丹’PoERF4基因qRT-PCR分析

根據(jù)PoERF4基因序列設計qRT-PCR特異性引物(表1),以‘鳳丹’actin基因為內(nèi)參基因,按照TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒的實驗體系和程序按說明書進行實驗,利用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量[19]。采用Excel整理數(shù)據(jù),SPSS 19.0軟件處理和分析數(shù)據(jù),Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 ‘鳳丹’PoERF4基因的克隆及推導的氨基酸序列

提取‘鳳丹’花瓣總RNA,以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,利用特異性引物進行RT-PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)在1 000 bp左右有1條清晰的特異性條帶(圖1),擴增到的片段長度為1 036 bp,開放閱讀框(ORF)為747 bp,編碼248個氨基酸,其ORF核苷酸序列與氨基酸見圖2。

M.DL2000 DNA marker; 1、2. PoERF4基因amplified product of PoERF4。

圖2 ‘鳳丹’PoERF4基因推導的氨基酸序列Fig.2 Deduced amino acid sequences of ‘Feng Dan’ PoERF4 gene

2.2 ‘鳳丹’PoERF4基因編碼蛋白理化性質(zhì)、保守結構域分析

PoERF4基因編碼的蛋白分子式為C2 217H3 689N747O933S174,分子質(zhì)量為61.315 56 kU,理論等電點(pI)為5.12,脂肪系數(shù)為23.96,不穩(wěn)定系數(shù)為34.92,數(shù)值小于40,因此預測其屬于穩(wěn)定蛋白。運用NCBI中CDD保守結構域數(shù)據(jù)庫進行保守結構域預測,結果顯示,該序列存在AP2超家族結構域和特殊DNA結合位點,可推斷PoERF4蛋白屬于AP2家族(圖3A)。

圖3 PoERF4基因編碼蛋白保守結構域預測,親疏水性、跨膜結構和磷酸化位點分析Fig.3 Prediction of conserved domain, affinity and hydrophobicity, transmembrane structure and phosphorylation site analysis of PoERF4 gene coding protein

2.3 ‘鳳丹’PoERF4蛋白親疏水性、跨膜結構、磷酸化位點分析

利用Protscale在線分析工具預測PoERF4基因編碼蛋白的親疏水性預測結果顯示,大多數(shù)氨基酸殘基落在親水區(qū),預測PoERF4蛋白表現(xiàn)為親水性蛋白(圖3B)?！P丹’PoERF4編碼蛋白跨膜結構在線分析顯示,所有蛋白均在膜外,不存在跨膜結構(圖3C)。用NetPhos軟件預測分析表明,PoERF4蛋白有Ser位點可能有17個被磷酸化,Thr位點可能有8個被磷酸化,Tyr位點可能有2個被磷酸化(圖3D)。

2.4 ‘鳳丹’PoERF4蛋白高級結構預測分析

使用在線分析工具SOPMA對‘鳳丹’PoERF4蛋白質(zhì)的二級結構進行預測分析,數(shù)據(jù)表明,該蛋白序列的二級結構中α-螺旋中包含28個氨基酸,延伸鏈中包含48個氨基酸,β-轉(zhuǎn)角中包含6個氨基酸,無規(guī)則卷曲中包含166個氨基酸,其中無規(guī)則卷曲為主要構件,且所占比例半數(shù)以上(圖4)。

圖4 PoERF4蛋白二級、三級結構預測Fig.4 PoERF4 secondary and tertiary structure prediction

2.5 ‘鳳丹’PoERF4蛋白系統(tǒng)進化樹分析

將PoERF4基因的氨基酸序列上傳至NCBI在線BLAST數(shù)據(jù)庫中挑選同源性較高的序列,利用MEGA軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建和遺傳距離分析,結果表明‘鳳丹’PoERF4與葡萄(Vitisvinifera)、夏葡萄(Vitisasetivalis)ERF4親緣關系較近,而與喜樹(Camptothecaacuminata)、茶(Camelliasinensis)等其他植物的親緣關系較遠(圖5)。

圖5 ‘鳳丹’PoERF4蛋白構建系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of PoERF4 construction in ‘Feng Dan’

2.6 ‘鳳丹’PoERF4基因的表達模式分析

以牡丹actin基因為內(nèi)參基因,采用熒光定量PCR技術分析PoERF4基因在‘鳳丹’牡丹花發(fā)育不同花期花瓣中的表達情況。結果顯示,PoERF4基因‘鳳丹’初開期和始衰期花瓣的表達量很低且無顯著差異,在露色期、半開期、盛開期和衰敗期花瓣的相對表達量上升,其中半開期花瓣的相對表達量最高(圖6A)。

CE .露色期the color-exposure stage; IF.初開期initial flowering stage; HO.半開期half opening stage; FB.盛開期full blooming stage; ID.始衰期initial decay stage; DS.衰敗期decay stage。

為研究PoERF4基因在‘鳳丹’不同組織(葉片、莖、花萼和花瓣)相同發(fā)育時期的時空表達模式,本研究采用qRT-PCR技術進行了分析。結果表明,PoERF4基因在葉片、莖、花萼和花瓣中均有表達,具有組織特異性,在葉片中相對表達量最高,顯著高于莖、花萼和花瓣的相對表達量(圖6B)。

對于不同品種PoERF4基因在牡丹晚花品種‘蓮鶴’中表達量最高,為27.63;其次是‘鳳丹’中的表達量,早花‘鳳丹’突變株系中表達量最低(圖6C)。

為探明‘鳳丹’牡丹PoERF4基因響應生長素的調(diào)控作用,收取‘鳳丹’經(jīng)100 μmol/L生長素處理下第1、2、4、8天的花瓣,提取所有組織RNA,進行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR分析,內(nèi)參基因為actin基因。處理結果如圖6D所示,生長素處理后的‘鳳丹’花瓣中,PoERF4基因在‘鳳丹’處理第8天時,表達豐度最高,是第1天的101倍,這表明PoERF4基因的表達受響應生長素的誘導且效果顯著(圖6D)。

3 討 論

植物葉、花、果實等器官的衰老脫落是一個高度程序化的過程,衰老相關基因和植物激素在此過程中共同調(diào)節(jié)脫落過程的進行[20]。本研究從‘鳳丹’花瓣中成功分離出ERF4基因cDNA序列全長,在線預測分析表明PoERF4基因含有完整的開放閱讀框,為747 bp,編碼248個氨基酸。對PoERF4基因編碼的蛋白分析發(fā)現(xiàn),PoERF4蛋白含有AP2超家族結構域和特殊DNA結合位點,屬于AP2/ERF家族,與茶(Camelliasinensis)[21]、紫花針茅(Stipapurpurea)[22]和蝴蝶蘭(Phalaenopsis)[23]等物種的AP2保守結構域一致。在親疏水性上,PoERF4蛋白為親水性蛋白,與‘碭山酥梨’(Pyrus‘Dangshansuli’)[24]、楊樹(Populus)[25]、芹菜(Apiumgraveolens)[26]等物種預測到的ERF4蛋白特性一致。在結構上,PoERF4蛋白均分布在膜外,不存在跨膜結構,表明該蛋白不屬于跨膜蛋白,與番茄(Solanumlycopersicum)[27]、小麥(Triticumaestivum)[28]等物種預測到的蛋白結構一致。這些生物信息學預測結果將為牡丹PoERF4基因功能的進一步探究奠定理論基礎。

利用RT-qPCR技術對PoERF4基因在‘鳳丹’不同花期、不同組織、不同牡丹品種和生長素誘導后的表達模式進行分析,結果顯示該基因在半開期的花瓣中表達量最高,表明PoERF4基因可能在花發(fā)育中期發(fā)揮重要作用。PoERF4在不同組織中均有表達,其中葉片表達量最高,在花萼和莖中表達量較低,表現(xiàn)出顯著的組織特異性,巴西橡膠(Heveabrasiliensis)HbERF4基因[29]、棉花(Gossypiumhirsutum)GhERF4基因[30]和辣椒(Capsicumannuum)AgERF4基因[31]均在葉片顯出組織特異性,有較高的表達量,推測其在植物生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮不同的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)在晚花品種‘蓮鶴’的PoERF1基因表達量顯著高于早花‘鳳丹’突變株系和‘鳳丹’。前人的研究表明,擬南芥ERF亞家族成員AtERF1基因可以抑制其在短日條件下開花[32]。在玫瑰中沉默RhERF113基因加速了玫瑰花的衰老[33]。由此推測ERF亞家族中部分成員可能具有延緩植物衰老的作用。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族作為連接植物信號的關鍵調(diào)節(jié)器,可以調(diào)節(jié)乙烯、細胞分裂素、赤霉素和脫落酸等植物激素的生物合成與轉(zhuǎn)錄過程,同時也對生長素和茉莉酸等植物激素作出響應[34]。PoERF4基因可受到外源生長素處理的誘導,表明該蛋白在參與花瓣脫落等生長發(fā)育過程中可能受到生長素信號通路的調(diào)節(jié)[13]。這些研究結果可為進一步探究‘鳳丹’牡丹PoERF4基因的功能提供參考,為植物花期調(diào)控基因工程的研究提供新的候選基因。