摘要 ［目的］驗(yàn)證國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法、最大或然數(shù)（most probable numbe，MPN）計(jì)數(shù)法檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的適用性。［方法］參照GB 4789.14—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》中平板計(jì)數(shù)法、MPN計(jì)數(shù)法檢測(cè)樣品中蠟樣芽孢桿菌濃度，對(duì)比不同方法的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)以蠟樣芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對(duì)照，驗(yàn)證方法的特異性。［結(jié)果］該方法具有特異性，能夠準(zhǔn)確檢出蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)，方法精密度和重復(fù)性好，回收率在84%～100%。［結(jié)論］2種方法均具有適用性和可操作性，均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)方法要求的技術(shù)指標(biāo)水平，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞 食品；蠟樣芽孢桿菌；方法驗(yàn)證；平板計(jì)數(shù)法；MPN計(jì)數(shù)法

中圖分類號(hào) TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2023）09-0184-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.044

Abstract ［Objective］To verify the applicability of national standard plate counting method and MPN counting method for detecting Bacillus cereus in food.［Method］The concentration of Bacillus cereus in samples was detected by the first method （plate counting method） and the second method （MPN counting method） according to GB 4789.14-2014 "National Standard for Food Safety，Microbiological Test of Food，Test for ?cereus"，and the detection results of different methods were compared.At the same time，Bacillus cereus was used as positive control，and Bacillus mycoides，Bacillus thuringiensis and Bacillus megaterium ?used as negative control to verify the specificity of the method.［Result］The method had specificity and could accurately detect the count of Bacillus cereus.The method had good precision and repeatability and the recovery rate was 84%-100%.［Conclusion］Both methods have applicability and operability，and can meet the technical index level required by the standard method，and the test results are accurate and reliable.

Key words Food;Bacillus cereus;Methods validation;Plate counting method;MPN counting method

作者簡(jiǎn)介 許涵秋（1986—），女，福建寧德人，工程師，從事食品安全檢測(cè)研究。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）自從1950年被Hauge氏首次報(bào)道其能引起食物中毒以來，就一直為人們所廣泛關(guān)注［1］。蠟樣芽孢桿菌是一種好氧、兼性厭氧的桿狀革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，屬于芽孢桿菌科蠟樣芽孢桿菌屬，能形成熱穩(wěn)定的內(nèi)生孢子，對(duì)環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性［2-3］。因此，它能夠廣泛存在于幾乎所有種類食品中，在乳制品、嬰幼兒食品、糧食、肉制品、海產(chǎn)品、蜂蜜及蔬菜水果等食品中均檢出過蠟樣芽孢桿菌［4-21］。蠟樣芽孢桿菌在水、空氣、土壤中也廣泛存在［22］，有研究表明，蠟樣芽孢桿菌在10～45 ℃、pH 2～11均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28～35 ℃，pH為4.3～9.3［23］。

2017年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生應(yīng)急中心發(fā)布的食物中毒事件數(shù)據(jù)顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件分別占食物中毒事件總數(shù)和中毒總?cè)藬?shù)的1.72%和3.63%，僅次于細(xì)菌性食物中毒、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌腸毒素，位列第五［24-25］。

2014—2016年，山西省共采集11類食品7 822份樣品進(jìn)行食源性致病菌檢測(cè)分析，蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，為11.0%［26］。2015—2020年，江西省豐城市采集轄區(qū)內(nèi)各類食品604份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果檢出12株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為1.99%［27］。2018年，吉林省共采集8個(gè)轄區(qū)內(nèi)各類外賣食品830份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果檢出40株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為4.82%［28］。2011—2015年，吉林省共采集9個(gè)轄區(qū)內(nèi)流通環(huán)節(jié)食品1 693份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果檢出557株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為32.90%，其中乳與乳制品的蠟樣芽孢桿菌污染最為嚴(yán)重，檢出率為39.45%；其次為餐飲食品和嬰幼兒配方食品，檢出率分別為31.49%和31.09%［29］。2020年，武漢市共采集各類食品200份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果檢出36株蠟樣芽孢桿菌，檢出率18.00%，為最高［30］。產(chǎn)毒素蠟樣芽孢桿菌按照食物中毒癥狀分為嘔吐型和腹瀉型2種，其分泌的毒素耐高溫、耐高壓，在食品加工過程中不能被分解，人們誤食被其污染的食品會(huì)引起嘔吐或者腹瀉，可以導(dǎo)致各種局部或全身性感染，如壞死性腸炎、肝功能衰竭、菌血癥和腦膜炎［31-33］，甚至導(dǎo)致死亡［34］。由此可見，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌是控制食品污染和感染后治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

我國(guó)現(xiàn)行的GB 31607—2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》首次在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了以米為主要原料制作的散裝即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量為10 000 CFU/g（mL），而在其他食品中還沒有限量要求，建議國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中增加其他類別食品特別是嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品的蠟樣芽孢桿菌指標(biāo)，更好地確保人民群眾食品安全。蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法依據(jù)GB 4789.14—2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》，但該標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)的部分操作步驟和細(xì)節(jié)沒有詳細(xì)說明，部分技術(shù)參數(shù)沒有明確規(guī)定，這些可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的不規(guī)范。

在使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)之前，實(shí)驗(yàn)室需證實(shí)能夠正確運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方法以驗(yàn)證其技術(shù)能力是否達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定要求［35］。該研究通過將蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌接種于腦心浸出液肉湯（BHI）制備成菌懸液，加標(biāo)于樣品中，按GB 4789.14—2014中平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)計(jì)數(shù)，并在重復(fù)條件下對(duì)2種定量方法進(jìn)行比較研究，驗(yàn)證方法的重復(fù)性、加標(biāo)回收率；同時(shí)以蠟樣芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對(duì)照，驗(yàn)證方法的特異性，為完善蠟樣芽孢桿菌定量檢測(cè)提供理論依據(jù)，也為制定相關(guān)技術(shù)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）［CMCC（B） 63303，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司］；蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）［CICC 21473，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心］；蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）［CICC 22945，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心］；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［CGMCC 1.0217，廣東微生物菌種保藏管理中心］。

腦心浸出液肉湯（BHI）、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、多黏菌素B、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯（TSB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、50%卵黃乳液、胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂、硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酪蛋白瓊脂、蠟樣芽孢桿菌生化鑒定試劑盒、革蘭氏染色液、動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基（A法）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；米糕（農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)小作坊）。

1.2 儀器與設(shè)備

SM 530自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；AC2-6S1生物安全柜（新加坡 ESCO科技有限公司）；SPX-250-Ⅱ 生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化。

將蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株從-80 ℃冰箱中取出，劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面活化，于36 ℃培養(yǎng)18～24 h。連續(xù)轉(zhuǎn)接2代，保證菌種的活性。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)菌液的制備。

用1 μL無菌接種環(huán)各勾取一環(huán)蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌于10 mL BHI培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 樣品和加標(biāo)樣稀釋液的制備。

稱取25 g米糕于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL PBS，制成10倍樣品稀釋液，重復(fù)2次。同時(shí)稱取24 g米糕于無菌均質(zhì)袋中，吸取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)菌液加入其中，加入225 mL PBS，制成10倍加標(biāo)樣稀釋液。

1.3.4 樣品的稀釋與接種（平板計(jì)數(shù)法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的樣品和加標(biāo)樣稀釋液置于9.0 mL無菌PBS稀釋液中，充分混勻制成1∶100的樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。根據(jù)對(duì)樣品濃度的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，分別吸取0.3、0.3、0.4 mL稀釋液于MYP瓊脂平皿內(nèi)，用L型涂布棒涂抹均勻。分別吸取0.3、0.3、0.4 mL空白稀釋液加入3個(gè)MYP瓊脂平皿內(nèi)作空白對(duì)照。靜置10 min，待樣液吸收后，將平板翻轉(zhuǎn)，（30±1） ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

1.3.5 樣品的稀釋與接種（MPN計(jì)數(shù)法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的樣品和加標(biāo)樣稀釋液置于9.0 mL無菌PBS稀釋液中，充分混勻制成1∶100的樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。根據(jù)對(duì)樣品濃度的估計(jì)，取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種于10 mL TSB中，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL于（30±1）℃培養(yǎng)48 h。用1 μL無菌接種環(huán)從各管中分別移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，（30±1） ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.6 菌種確定和鑒定。參照GB 4789.14—2014進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定盒生化分型鑒定。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落于高倍（16×100）顯微鏡下進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，按GB 4789.14—2014中步驟進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪蛋白分解試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、葡萄糖利用（厭氧）試驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)等生化分型鑒定試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果

按照“1.3”的試驗(yàn)方法，進(jìn)行培養(yǎng)、驗(yàn)證和計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1～2所示。經(jīng)過計(jì)數(shù)，混合標(biāo)準(zhǔn)菌液中蠟樣芽孢桿菌的平均含量為4.7×106 CFU/mL，折算為25 g加標(biāo)樣中蠟樣芽孢桿菌的含量為1.9×105 CFU/g。

2.2 2種方法的實(shí)際樣本加標(biāo)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較

根據(jù)表1～2結(jié)果，25 g加標(biāo)樣中蠟樣芽孢桿菌的含量為1.9×105 CFU/g，回收率以平均值除以1.9×105乘以100計(jì)算，得平板計(jì)數(shù)法的回收率為84.2%、MPN計(jì)數(shù)法的回收率為100%。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明2種方法均能較好地計(jì)數(shù)食品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)方法分析，運(yùn)用F檢驗(yàn)法進(jìn)行等精度測(cè)量判定，T檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)一致性判定，判定結(jié)果如表4所示。計(jì)算步驟如下：

（1）統(tǒng)計(jì)量F（f1，f2）=S12S22，式中，S1為兩組對(duì)比數(shù)據(jù)的大值標(biāo)準(zhǔn)偏差；S2為兩組對(duì)比數(shù)據(jù)的小值標(biāo)準(zhǔn)偏差；自由度f(wàn)1=n1-1，f2=n2-1；次數(shù)n1=n2=3。經(jīng)計(jì)算，F(xiàn)（f1，f2）=1.00;取顯著水平α=0.05，查F分布臨界值表得概率p=0.95水平下F0.95（2，2）=19.00，可得F（f1，f2）＜F0.95（2，2），可判斷兩組對(duì)比數(shù)據(jù)屬于等精度測(cè)量。

（2）統(tǒng)計(jì)量T=1-2Spn1n2n1+n2，SP=（n1-1）S12+（n2-1）S22n1+n2-2，式中，1、2為兩組對(duì)比數(shù)據(jù)平均值；S1、S2為兩組對(duì)比數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差；Sp為兩組對(duì)比數(shù)據(jù)合并標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算得T=1.061；取顯著水平α=0.05，自由度f(wàn)=n1+n2-2=3+3-2=4，查T分布雙側(cè)臨界值表得tα，f=t0.05，4=2.776?？傻肨＜tα，f，可判斷兩組對(duì)比數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

結(jié)果說明2種方法檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)性相對(duì)較小，精密度和重復(fù)性較好，有利于結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。

2.3 確定和鑒定結(jié)果

2.3.1 革蘭氏染色鏡檢。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明4種菌株均為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，大多呈短鏈排列。其中巨大芽孢桿菌呈單個(gè)或短鏈排列，部分菌鏡檢結(jié)果呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，可能由于其活化效果不佳，菌體死亡或自溶使部分陽(yáng)性菌呈陰性反應(yīng)。

2.3.2 MYP瓊脂平板上菌落形態(tài)。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上的培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌的典型菌落為粉紅色，表示不發(fā)酵甘露醇，周圍有白色沉淀環(huán)，表示產(chǎn)卵磷脂酶；蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的典型菌落為粉紅色，其中蘇云金芽孢桿菌周圍有粉色沉淀環(huán)；巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生長(zhǎng)受抑制，典型菌落為灰白色，培養(yǎng)基紅色褪去而顯示出淡黃色，表示發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，并且周圍無沉淀環(huán)，表明該菌株在MYP瓊脂平板上不產(chǎn)卵磷脂酶。

2.3.3 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落形態(tài)。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈灰白色，不透明，表面呈融蠟狀，邊緣呈擴(kuò)展?fàn)睿睆?～10 mm，呈粗糙山谷狀生長(zhǎng)的特征。蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長(zhǎng)的特征，蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均無上述生長(zhǎng)典型特征。

2.3.4 動(dòng)力試驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)菌株動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌在動(dòng)力培養(yǎng)基中沿穿刺線呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌沿穿刺線呈弱擴(kuò)散生長(zhǎng)，蕈狀芽孢桿菌沿穿刺線呈絨毛狀生長(zhǎng)。

2.3.5 溶血試驗(yàn)。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的溶血試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌在TSSB瓊脂平板上產(chǎn)溶血素，有完全溶血環(huán)；蕈狀芽孢桿菌在TSSB瓊脂平板上為弱溶血，巨大芽孢桿菌為不溶血。

2.3.6 酪蛋白分解試驗(yàn)。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的酪蛋白分解試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌菌株在酪蛋白瓊脂平板上均呈陽(yáng)性反應(yīng)，說明這些菌株均能分解培養(yǎng)基的酪蛋白，使得培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色，生成的L-酪氨酸在菌落周圍形成透明圈；而巨大芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在酪蛋白瓊脂平板上無上述現(xiàn)象。

2.3.7 蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的酪蛋白分解試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明4種菌株均有產(chǎn)生游離芽孢（淺紅色），其中僅蘇云金芽孢桿菌有產(chǎn)生菱形蛋白色結(jié)晶體（深紅色）。

2.3.8 其他生化特征。

采用生化試劑盒鑒定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌的生化特征和蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌十分相似。雖然淀粉和明膠的試驗(yàn)?zāi)苡行^(qū)分蠟樣芽孢桿菌與其他芽孢桿菌，但不能僅以這2項(xiàng)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定歸屬的菌種。

3 結(jié)論與討論

近年來，國(guó)內(nèi)外食品中的蠟樣芽孢桿菌檢出率較高，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)正確地按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)確檢驗(yàn)食品中的蠟樣芽孢桿菌顯得十分重要。該研究通過對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.14—2014中的2種定量方法（平板計(jì)數(shù)法、MPN計(jì)數(shù)法）進(jìn)行比較研究，并在重復(fù)條件下對(duì)2種方法與實(shí)際添加菌數(shù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，平板計(jì)數(shù)法、MPN計(jì)數(shù)法均能夠很好地計(jì)數(shù)食品中蠟樣芽孢桿菌的含量，方法精密度和重復(fù)性較好，回收率在84%～100%。

同時(shí)，該研究以蠟樣芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對(duì)照，通過多種形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)，驗(yàn)證方法的特異性，結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、TSSB瓊脂平板上的菌落形態(tài)存在不同程度差異，可以據(jù)此將它們區(qū)分開來，并以其他生化特征反應(yīng)為輔助手段；其中營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)?zāi)苡行цb別蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌大部分生化試驗(yàn)結(jié)果都相似，只有通過蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)?zāi)苡行цb別開。因此，通過MYP瓊脂平板分離純培養(yǎng)后，以根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)為關(guān)鍵手段，以形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)為輔助手段，可以有效鑒別出蠟樣芽孢桿菌，大幅降低蠟樣芽孢桿菌的結(jié)果假陽(yáng)性率。總之標(biāo)準(zhǔn)方法具有特異性，能夠有效鑒別出蠟樣芽孢桿菌。

目前，參照國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的可參考文獻(xiàn)較少，對(duì)部分操作步驟細(xì)節(jié)和部分技術(shù)參數(shù)沒有明確規(guī)定。如一是國(guó)標(biāo)中未對(duì)酪蛋白分解試驗(yàn)中陰陽(yáng)性反應(yīng)的試驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行說明與解釋；二是蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)，只有當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生大量游離芽孢，毒素結(jié)晶體才會(huì)釋放出來，才有可能通過染色鏡檢觀察到這些結(jié)晶體的形態(tài)。因此，這個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵是如何讓細(xì)菌在最短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的游離芽孢?？砂礃?biāo)準(zhǔn)將單個(gè)可疑菌落接種于硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，（30±1）℃培養(yǎng)3～4 d。如鏡檢時(shí)未見游離芽孢，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，直至見到大量游離芽孢為止。染色鏡檢過程中應(yīng)嚴(yán)格控制甲醇作用時(shí)間及染色時(shí)間，清洗時(shí)要徹底。蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶體的形態(tài)是多樣的，有菱形、圓形等，并且大小不一。

綜上所述，國(guó)標(biāo)中的平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法在檢測(cè)較高濃度的蠟樣芽孢桿菌時(shí)均具有適用性和可操作性，均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)方法要求的技術(shù)指標(biāo)水平，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但因該試驗(yàn)未對(duì)低濃度蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)，未能驗(yàn)證2種方法在不同蠟樣芽孢桿菌含量的食品中適用性，因此還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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