單雪芹 凡玉芳 沈詠舟 王亞男 韓國祥

摘要 ［目的］篩選抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的有效中藥單體及其作用節(jié)點(diǎn)。［方法］選擇3種中藥單體進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)，通過對病毒3個節(jié)點(diǎn)（抑制吸附穿入、直接殺滅、抑制復(fù)制）進(jìn)行藥物作用，評價CCK-8法、間接免疫熒光法和Western blot的對抗病毒效果。［結(jié)果］黃芩苷和水飛薊在病毒吸附和穿入階段抗病毒效果好，而訶子抗病毒效果較差；CCK-8測試顯示，黃芩苷和水飛薊最大抑制率分別為82.34%和78.00%，間接免疫熒光和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證黃芩苷和水飛薊能降低綠色熒光強(qiáng)度及抑制病毒N蛋白的表達(dá)，且2種藥物抗病毒作用均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。［結(jié)論］該研究結(jié)果可為后續(xù)抗PEDV藥物的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 豬流行性腹瀉病毒；中藥；抗病毒作用

中圖分類號 S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.016

Abstract ［Objective］In order to screen effective traditional Chinese medicine monomers and their action nodes against PEDV.［Method］Three traditional Chinese medicine monomers were selected for in vitro antiviral test.Through the drug action on the three nodes of the virus （inhibition of adsorption penetration，direct killing，inhibition of replication），the antiviral effect was evaluated by CCK8 method，indirect immunofluorescence method and Western blot.［Result］The results showed that baicalin and silymarin had the best antiviral effect at the stage of virus adsorption and penetration，while chebula had a poor antiviral effect.CCK8 test showed that the maximum inhibition rates of baicalin and silymarin were 82.34% and 78% respectively.Indirect immunofluorescence and Western blot further verified that baicalin and silymarin could reduce the intensity of green fluorescence and inhibit the expression of viral N protein，and the antiviral effects of the two drugs showed a certain concentration dependence.［Conclusion］The results of this study can provide a basis for the subsequent screening of anti PEDV drugs.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;Traditional Chinese medicine;Antiviral effect

基金項(xiàng)目 蕪湖市科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020yf50）。

作者簡介 單雪芹（1987—），女，安徽蚌埠人，工程師，碩士，從事微生物與免疫學(xué)研究。

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的仔豬和育肥豬的一種急性腸道傳染病。該病可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率越高［1］。PEDV暫無商品化特效治療藥物，主要依靠疫苗進(jìn)行預(yù)防，但變異株的出現(xiàn)使疫苗保護(hù)力急劇下降，且弱毒疫苗存在一定的返強(qiáng)風(fēng)險［2-3］。臨床防治亦采用抗生素、激素等藥物，但長期使用會導(dǎo)致致病菌耐藥性增加和豬肉產(chǎn)品藥物殘留，降低療效的同時增加公共衛(wèi)生安全風(fēng)險，嚴(yán)重危害人類健康［4-5］。我國中藥資源豐富，且其具有低耐藥性、低毒性、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，目前已知較多中藥具備增強(qiáng)免疫力及抗病毒作用［6］，大量研究亦表明，中藥能有效防治 PEDV 引起的仔豬腹瀉［7］。

中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為，豬 PED 屬于外邪犯脾胃，毒邪濕氣蘊(yùn)積體內(nèi)所致，而仔豬為稚陽之體，脾胃素弱，飼養(yǎng)不當(dāng)、寒熱不調(diào)等侵入均可導(dǎo)致脾胃功能失調(diào)而引發(fā)仔豬腹瀉，因此可采用清熱解毒、健脾祛濕、止瀉收斂等治療原則［8］。黃芪具有健脾補(bǔ)中，升陽舉陷，益衛(wèi)固表，利尿，托毒生肌的功效，主治脾氣虛證、肺氣虛證等［9］。訶子可澀腸止瀉，斂肺止咳，常用于治療久瀉久痢，便血脫肛［10］。水飛薊性味苦涼，有清熱、解毒、保肝利膽作用［11］。3種藥物從功效上看，均可對PED產(chǎn)生治療作用，其中發(fā)酵黃芪多糖產(chǎn)物對PEDV疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用已得到證實(shí)［12］，而訶子和水飛薊對PEDV的影響鮮見報(bào)道。筆者選取 3 種中藥進(jìn)行體外抗 PEDV 研究，以期獲得較好的抗 PEDV 的有效中藥單體，為后續(xù)抗病毒藥物的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和細(xì)胞。非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）、PEDV HS株由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑。

黃芩苷（HPLC≥85%）、水飛薊（10∶1 提取物）、訶子（10∶1 提取物）均購自寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；1M Tris-HCl、CCK-8 試劑盒、4%多聚甲醛固定液和RIPA 裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、DMEM、辣根過氧化物酶（HRP）化學(xué)發(fā)光底物均購自Thermo公司；PEDV N 蛋白單克隆抗體購自Medgene Labs 公司；FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、小鼠抗 GAPDH 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG均購自生工生物工程（上海股份有限公司）；脫脂牛奶、PBS、牛血清蛋白 V（BSA-Ⅴ）均購自北京索萊寶科技有限公司；Triton X-100購自北京酷來搏科技有限公司；彩色電泳蛋白 Marker（10-250 KDa）購自Bio-Rad 公司。

1.1.3 主要儀器。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；酶標(biāo)儀、濕轉(zhuǎn)膜裝置、蛋白電泳儀（Bio-Rad 公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司）；脫色搖床（TS-100 海門麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 間接免疫熒光法測定 PEDV 病毒滴度。

選取生長狀況良好的Vero細(xì)胞，消化后按100 μL/孔接種至96孔板內(nèi)，置于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。將HS株用細(xì)胞維持液進(jìn)行稀釋，稀釋度為10-1～10-10，待細(xì)胞長至90%時，棄去培養(yǎng)基，并將稀釋好的病毒液按100 μL/孔接種至96孔板內(nèi)，每個濃度設(shè)置8個重復(fù)，置于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。

取出96孔板，棄生長液，按100 μL/孔加入4%多聚甲醛固定液，4 ℃固定30 min，用PBS 200 μL/孔洗滌3次，每次5 min；0.5% TritonX-100按100 μL/孔室溫通透20 min，用相同方法洗滌；封閉液按100 μL/孔室溫?fù)u床封閉1h，用相同方法洗滌；加入一抗（1∶1 000 PBS稀釋），50 μL/孔，4 ℃過夜孵育，用相同方法洗滌；加入熒光二抗（1∶100 PBS稀釋），50 μL/孔，全程避光操作，室溫?fù)u床孵育1 h，用相同方法洗滌；加入適量PBS保持濕潤；之后用熒光顯微鏡觀察，記錄熒光灶數(shù)目。按Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID50。

1.2.2 中藥單體最大無毒劑量的測定。

將中藥溶解至DMSO中使其終濃度為100 mg/mL，用細(xì)胞維持液稀釋中藥使其終濃度為1 mg/mL（含1%DMSO），在此基礎(chǔ)上進(jìn)行倍比稀釋。待96孔板鋪滿單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按100 μL/孔向其加入稀釋好的藥液，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)，另設(shè)正常細(xì)胞對照及含有1% DMSO對照，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率大于90%的藥物濃度即為該藥物最大無毒劑量。

1.2.3 3種中藥單體最佳作用濃度及作用節(jié)點(diǎn)的篩選。

試驗(yàn)選取黃芩苷、水飛薊和訶子 3 種中藥單體，分別通過 3 個作用節(jié)點(diǎn)（抑制吸附穿入、直接殺滅、抑制復(fù)制）進(jìn)行體外抗 PEDV 試驗(yàn)，采用 CCK-8 法檢測細(xì)胞 OD450 nm 值，并計(jì)算病毒抑制率。在藥物最大無毒劑量范圍內(nèi)，用細(xì)胞維持液將藥物倍比稀釋成 4 個濃度（表1），分裝待用。

1.2.3.1 中藥對 PEDV 阻斷作用的測定。

待 Vero 細(xì)胞單層時，棄細(xì)胞生長液，按100 μL/孔加入已稀釋好的藥液，每個濃度設(shè)置6個孔，37 ℃ 5% CO2 作用4 h，棄藥液，按100 μL/孔加入 100 TCID50 PEDV，同時設(shè)立正常細(xì)胞及病毒對照，置于 37 ℃ 5% CO2作用2 h，棄病毒液，每孔加入100 μL細(xì)胞維持液，置于37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)96 h。之后采用 CCK-8 法檢測細(xì)胞 OD450 nm 值，并計(jì)算病毒抑制率。

1.2.3.2 中藥對 PEDV 直接殺滅作用的測定。

將稀釋好的藥液與100 TCID50 PEDV 混合，4 ℃作用4 h，然后按照100 μL/孔將混合液加入單層Vero細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每個藥物濃度設(shè)置6個孔，同時設(shè)立正常細(xì)胞及病毒對照，37 ℃ 5% CO2 作用2 h，棄去混合液及病毒液，每孔加入100 μL細(xì)胞維持液，置于 37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)96 h。之后采用 CCK-8 法檢測細(xì)胞 OD450 nm 值，并計(jì)算病毒抑制率。

1.2.3.3 中藥對 PEDV 抑制作用的測定。

觀察孔板內(nèi)的Vero細(xì)胞，待細(xì)胞單層時，棄細(xì)胞生長液，按100 μL/孔加入100 TCID50 PEDV，37 ℃ 5% CO2 作用2 h，棄病毒液，按100 μL/孔加入已稀釋好的藥液，每個藥物濃度重復(fù)6個孔，同時設(shè)立正常細(xì)胞及病毒對照，置于 37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)96 h。之后采用CCK-8法檢測細(xì)胞OD450 nm值，并計(jì)算病毒抑制率。

1.2.4 有效抗病毒作用節(jié)點(diǎn)試驗(yàn)。篩選出對病毒抑制率大于50%的中藥單體及藥物作用節(jié)點(diǎn)。

1.2.4.1 間接免疫熒光法檢測抗病毒作用。

將生長狀況良好的細(xì)胞鋪至96孔板，待孔底鋪滿單層細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，按100 μL/孔加入已稀釋好的藥液，37 ℃ 5% CO2作用4 h，棄去藥液，按100 μL/孔加入100 TCID50 PEDV，同時設(shè)立正常細(xì)胞組對照及病毒組對照，置于37 ℃ 5% CO2作用2 h，棄去病毒液，按100 μL/孔加入細(xì)胞維持液，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)16 h，棄細(xì)胞生長液，將單層細(xì)胞用于間接免疫熒光法檢測。

1.2.4.2 Western blot 法檢測抗病毒作用。

將生長狀況良好的細(xì)胞鋪至6孔板，待孔底鋪滿單層細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，按2 mL/孔加入已稀釋好的藥液，37 ℃ 5% CO2 作用4 h，棄去藥液，按1 mL/孔加入 1 000 TCID50 PEDV。同時設(shè)立正常細(xì)胞及病毒對照，置于 37 ℃ 5% CO2 作用 2 h，棄病毒液，按 2 mL/孔加入細(xì)胞維持液，置于37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)16 h，收集細(xì)胞用于Western blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV 病毒滴度

分別將稀釋度為 10-1～-10-10 的病毒液接種至 96 孔板，置于 37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng) 72 h后，用間接免疫熒光法檢測每個孔中的 PEDV 熒光灶（圖1）。經(jīng)觀察，PEDV 引起的病變情況按照 Reed-Muench 公式計(jì)算 TCID50，該病毒 TCID50 為 10-5.5/0.1 mL。

2.2 中藥最大無毒劑量

加入不同濃度藥物培養(yǎng)96 h后，按照CCK-8法檢測細(xì)胞OD450 nm值，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率大于90%時，該濃度為藥物最大無毒劑量。如圖2所示，各藥物最大無毒劑量黃芩苷為31.3 μg/mL，水飛薊為31.3 μg/mL，訶子為3.9 μg/mL。

2.3 中藥單體及作用節(jié)點(diǎn)的篩選結(jié)果

2.3.1 中藥阻斷病毒吸附穿入的檢測結(jié)果。

如圖3所示，3 種中藥對病毒均有一定的抑制作用，且黃芩苷與水飛薊的病毒最大抑制率分別為 82.34%和78.00%。黃芩苷對病毒的抑制呈現(xiàn)明顯的濃度依賴，不同濃度間抑制率差異極顯著（P<0.01），濃度越高，抑制率越高；水飛薊不同濃度間抑制率差異不顯著（P>0.05），說明水飛薊對病毒抑制作用較為穩(wěn)定。

2.3.2 中藥直接殺滅病毒的檢測結(jié)果。

如圖4所示，3種中藥對病毒的抑制作用均較差，黃芩苷與訶子對病毒最大抑制率分別為33.05%和30.55%，水飛薊對PEDV無抑制作用，揭示黃芩苷、訶子和水飛薊直接殺滅PEDV作用較差。

2.3.3 中藥抑制病毒復(fù)制的檢測結(jié)果。

根據(jù)所測的 OD450 nm 值，計(jì)算各中藥濃度對病毒的抑制率，結(jié)果如圖5所示。從圖5可見，黃芩苷對病毒幾乎無抑制作用，訶子對病毒的抑制作用很微弱，水飛薊最大抑制率為 10.78%，揭示黃芩苷、訶子和水飛薊無抑制 PEDV 復(fù)制的作用。

2.4 有效抗病毒作用的試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 間接免疫熒光。

結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理的病毒組顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光信號，相反，經(jīng)藥物處理后的試驗(yàn)組綠色熒光信號減弱，隨著黃芩苷（圖6）和水飛薊（圖7）濃度的降低，熒光信號強(qiáng)度開始增加，顯示出2種藥物的抗病毒作用均有一定的濃度依賴性。

2.4.2 Western blot。

隨著黃芩苷和水飛薊濃度的降低，病毒核衣殼蛋白均以類似的劑量依賴性方式增加，且黃芩苷劑量依賴性更強(qiáng)，這與 CCK-8 的檢測結(jié)果和間接免疫熒光的檢測結(jié)果一致。黃芩苷和水飛薊在 C1 濃度時 N 蛋白幾乎檢測不到（圖8）。

3 討論

PED 主要危害仔豬，導(dǎo)致其高發(fā)病率和死亡率，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。盡管已經(jīng)開發(fā)了多種PEDV疫苗，但是疫苗和田間流行毒株的差異性導(dǎo)致疫苗保護(hù)性較差［13］。截至目前，尚未開發(fā)出可用于 PEDV 的藥物并在臨床中使用。因此，迫切需要探究新型抗 PEDV 藥物以消除 PED 的威脅。天然化合物和組合物已成為抵抗多種病毒感染的豐富藥物來源。例如，格瑞弗森（Griffithsin）是一種高甘露糖特異性凝集素，已被證明可以通過防止病毒吸附和阻斷 PEDV 在細(xì)胞間的傳播來減少 Vero 細(xì)胞中的 PEDV 感染［14］。從檸檬清風(fēng)藤（Sabia limoniacea）葉片中提取的丙烯基酚類化合物對 PEDV 的復(fù)制具有良好的抗病毒活性［15］。

PEDV 生命周期包括4個階段：吸附、穿入、復(fù)制和釋放［16］。該研究從 3 種中藥中篩選出最有效的抗病毒中藥及其抗病毒作用階段。

該研究先確定 3 種藥物最大無毒劑量，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，最大程度減少藥物毒性對細(xì)胞存活率的影響。采用 CCK-8 法測得細(xì)胞存活率，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色（顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系）［17］。通過 3 種不同作用方式來確定藥物的最佳作用階段，即阻斷病毒的吸附、直接殺滅病毒、抑制病毒釋放，3個作用方式與臨床中預(yù)防、消毒和治療的試驗(yàn)設(shè)計(jì)相似［18］。結(jié)果表明，在病毒吸附穿入階段，3 種藥物均顯示出抑制病毒感染，其中黃芩苷和水飛薊抑制作用效果較好，最大抑制率分別為 82.34%和 78.00%。在篩選出有效中藥及其作用階段后，通過間接免疫熒光和 Western blot 進(jìn)一步分析黃芩苷和水飛薊的抗病毒作用。結(jié)果顯示，2種藥物抗病毒作用均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，藥物濃度越高，熒光信號越弱，N 蛋白表達(dá)量越低。N 蛋白在受感染的細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生，且具有多種功能，包括與病毒 RNA 結(jié)合以形成核糖核衣殼，在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮作用［19］。黃芩苷和水飛薊降低了細(xì)胞內(nèi) PEDV N 蛋白的表達(dá)，說明入侵細(xì)胞的 PEDV數(shù)量減少，再次證實(shí)黃芩苷和水飛薊阻斷了 PEDV 對細(xì)胞的吸附穿入。

水飛薊提取物內(nèi)含有大量黃酮類化合物，主要為水飛薊素［20］。水飛薊素包括水飛薊賓（silybin）、異水飛薊賓（isosilybin）、水飛薊寧（silydianin）、水飛薊亭（silychristin）等［21］。同樣，黃芩苷也屬于黃酮類化合物。黃酮類的藥理特性包括抗菌、抗氧化、抗炎和抗病毒等功能［22］。目前已有針對黃酮類化合物對多種 DNA 和 RNA 病毒進(jìn)行了抗病毒研究［23］。其作用機(jī)理包括對冠狀病毒 3CL 蛋白酶（3CLpro）的抑制作用［24-25］，同樣甾體生物堿番茄素（Tomatidine）亦通過抑制 3CLpro 的活性顯著抑制了 PEDV 的復(fù)制［26］；破壞病毒 RNA 與異質(zhì)性胞核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonuc leoproteins）的結(jié)合來抑制腸道病毒 71 型感染［27］；干擾神經(jīng)氨酸酶活性，破壞H5N1 型禽流感病毒在人肺上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞中的復(fù)制［28］。該研究發(fā)現(xiàn)了黃芩苷和水飛薊可以抑制 PEDV 吸附穿入細(xì)胞，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 黃龍，趙世源，高菊梅，等.豬流行性腹瀉的診斷報(bào)告［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會第二十一次學(xué)術(shù)研討會暨中國病理生理學(xué)會動物病理生理學(xué)專業(yè)委員會第二十次學(xué)術(shù)研討會 論文集.［出版地不詳］：［出版者不詳］，2015：165.

［2］ 楊盼盼.表達(dá)PEDV中國變異株S基因重組偽狂犬病病毒構(gòu)建［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［3］ 胡興義，張雙翔，馮旭芳，等.豬病毒性腹瀉（PED）疫苗免疫后母豬乳汁中PEDV IgA消長動態(tài)［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，37（9）：1659-1663.

［4］ 代新光，馮雪冰.基層醫(yī)院中用維生素抗生素激素藥物的憂患［J］.中外醫(yī)療，2009，28（5）：165.

［5］ 中農(nóng).抗生素可用但不可濫用［J］.農(nóng)業(yè)知識：科學(xué)養(yǎng)殖，2013（4）：18.

［6］ 孫耀華，楊勁松.中獸藥的臨床應(yīng)用之抗病毒和增強(qiáng)免疫力的中草藥［J］.獸藥市場指南，2021（2）：38-39.

［7］ 劉衍芬，李艷飛，鄂祿祥.中藥復(fù)方對人工感染豬流行性腹瀉病毒仔豬的治療效果研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（9）：155-158，298.

［8］ 朱國強(qiáng).豬流行性腹瀉的中獸醫(yī)辨證分析［J］.畜牧業(yè)環(huán)境，2020（10）：87-88.

［9］ 張煥，王玉龍，劉秋燕，等.淺析黃芪藥對在方劑配伍中的意義（摘要）［C］//中華中醫(yī)藥學(xué)會2014第七次臨床中藥學(xué)術(shù)研討會論文集.［出版地不詳］：［出版者不詳］，2014：125-126.

［10］ 羅光偉，陳建江.訶子的藥理作用研究進(jìn)展［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2012，33（11）：78-80.

［11］ 鞠雷，王曉丹，劉占民.水飛薊煎劑對ICR小鼠撲熱息痛肝損傷的保護(hù)作用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（11）：90-92.

［12］ 王亭亭.黃芪發(fā)酵多糖提取物組份鑒定及其對豬流行性腹瀉的免疫調(diào)節(jié)作用［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［13］ CHEN N H，LI S J，ZHOU R Y，et al.Two novel porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） recombinants from a natural recombinant and distinct subtypes of PEDV variants［J］.Virus research，2017，242：90-95.

［14］ 陳兵.中藥復(fù)方健脾止瀉散對仔豬流行性腹瀉防治效果研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［15］ CHO H M，HA T K Q，DANG L H，et al.Prenylated phenolic compounds from the leaves of Sabia limoniacea and their antiviral activities against porcine epidemic diarrhea virus.［J］.Journal of natural products，2019，82（4）：702-713.

［16］ WANG Y H，GRUNEWALD M，PERLMAN S.Coronaviruses： An updated overview of their replication and pathogenesis［J］.Methods in molecular biology，2020，2203：1-29.

［17］ 郭玲，王敏，郝亮.胰島素樣生長因子1對小鼠成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（33）：6095-6098.

［18］ 布瑋瑋.河南省PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查及體外抗病毒中藥單體的篩選［D］.洛陽：河南科技大學(xué)，2014.

［19］ MCBRIDE R，VAN ZYL M，F(xiàn)IELDING B C.The coronavirus nucleocapsid is a multifunctional protein［J］.Viruses，2014，6（8）：2991-3018.

［20］ 閆玉峰，于健東.水飛薊的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.中國藥事，2000，14（5）：335-337.

［21］ 陳香.水飛薊提取物中黃酮成分分析［J］.現(xiàn)代儀器，2012，18（5）：83-85.

［22］ RUSSO M，MOCCIA S，SPAGNUOLO C，et al.Roles of flavonoids against coronavirus infection［J］.Chemicobiological interactions，2020，328：1-13.

［23］ LALANI S，POH C L.Flavonoids as antiviral agents for Enterovirus A71 （EV-A71）［J］.Viruses，2020，12（2）：1-34.

［24］ JO S，KIM S，SHIN D H，et al.Inhibition of SARSCoV 3CL protease by flavonoids［J］.Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry，2020，35（1）：145-151.

［25］ JO S，KIM H，KIM S，et al.Characteristics of flavonoids as potent MERSCoV 3Clike protease inhibitors［J］.Chemical biology & drug design，2019，94（6）：2023-2030.

［26］ WANG P C，BAI J，LIU X W，et al.Tomatidine inhibits porcine epidemic diarrhea virus replication by targeting 3CL protease［J］.Veterinary research，2020，51（1）：1-18.

［27］ ZHANG W，QIAO H S，LV Y Z，et al.Apigenin inhibits enterovirus71 infection by disrupting viral RNA association with transacting factors［J］.PLoS One，2014，9（10）：1-9.

［28］ SITHISARN P，MICHAELIS M，SCHUBERTZSILAVECZ M，et al.Differential antiviral and anti-inflammatory mechanisms of the flavonoids biochanin A and baicalein in H5N1 influenza A virusinfected cells［J］.Antiviral research，2013，97（1）：41-48.