張芮，劉文虎，張立強(qiáng)，楊陽(yáng)，魏陽(yáng)，王松濤，冉茂芳，王世寬，沈才洪*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川自貢 643000；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司/國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

大曲是傳統(tǒng)白酒釀造的重要原料之一，起到糖化、發(fā)酵、酒化和生香的作用，對(duì)白酒的出酒率和酒質(zhì)有極大的影響[1-3]。根據(jù)曲坯中心最高發(fā)酵溫度的不同，大曲分為低溫大曲（45～50 ℃）、中溫大曲（50～60 ℃）和高溫大曲（60～65 ℃），其中，高溫大曲用于醬香型白酒的生產(chǎn)。高溫大曲以小麥為主要原料，經(jīng)自然堆積發(fā)酵而成，原料粉碎、水分含量、發(fā)酵溫度、安曲方式、發(fā)酵方式、過(guò)程管控等是影響高溫大曲質(zhì)量的重要因素，上述因素的差異導(dǎo)致曲藥表面呈現(xiàn)黑褐色（黑曲）、黃褐色（黃曲）和生麥色（白曲）[4-6]。正常情況下，高溫大曲發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)黃曲的占比最高，占總產(chǎn)量的70 %～80 %，黑曲和白曲分別占10%和10%～20%。黑曲通常出現(xiàn)在發(fā)酵房中央，白曲通常出現(xiàn)在頂層或靠近門(mén)窗的位置[7]。由不同因素產(chǎn)生的3種高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)各不相同，黃曲和黑曲中的優(yōu)勢(shì)菌分別為克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），白曲中的主要細(xì)菌及真菌類(lèi)群分別為海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）[8]。黑曲、黃曲和白曲之間的理化性質(zhì)和生物酶活力存在顯著差異，黑曲的酸度最高，黃曲最低；白曲的糖化力和酯化力最高，黑曲的最低[9]。Deng等[10]利用擴(kuò)增子測(cè)序手段對(duì)采集自不同地區(qū)、不同顏色的高溫大曲進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）為高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)微生物，此外，黑曲中的主要菌群還包括糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）和嗜熱真菌屬（Thermomyces），黃曲中的優(yōu)勢(shì)菌群還包括未分類(lèi)的散囊菌目（Eurotiales）真菌，表明黑曲、白曲和黃曲的理化指標(biāo)、酶活力及功能微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

目前，高溫大曲的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，涉及了功能微生物、理化指標(biāo)和風(fēng)味差異等方面，但對(duì)功能微生物功能層面的研究相對(duì)較少。本文基于宏基因組學(xué)，對(duì)同批次黑、黃、白色高溫大曲微生物群落與功能組成進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步預(yù)測(cè)引起3種高溫大曲品質(zhì)差異的代謝途徑，為深入闡明高溫大曲的異質(zhì)性奠定了基礎(chǔ)，以期指導(dǎo)3種高溫大曲在醬香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣品

高溫大曲樣品采自貯曲倉(cāng)不同位置且貯存了3個(gè)月的白曲（White_Daqu）、黃曲（Yellow_Daqu）和黑曲（Black_Daqu）各3 塊。分別粉碎混勻后，裝于無(wú)菌自封袋中，貯存于-20 ℃待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取和宏基因組測(cè)序

稱(chēng)取10g 高溫大曲樣品，用中通量組織研磨儀（鼎昊源，中國(guó)）結(jié)合液氮冷凍研磨成細(xì)粉。采用土壤DNA 試劑盒（Omega，美國(guó)）提取DNA，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，采用Nano‐Drop2000 微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）檢測(cè)DNA 純度和濃度。合格的DNA 樣品用干冰寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用HiSeqTM X Ten 系統(tǒng)（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.2.2 序列處理和注釋

使用SOAPnuke（v1.5.6）[11]對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾：去除包含不確定堿基（N 堿基）的序列，去除含50%以上低質(zhì)量堿基（Q＜20 的堿基）的序列，去除含測(cè)序接頭的序列，去除長(zhǎng)度＜50 bp 的序列，使用snap-aligner (v1.0beta.23)[12]和samtools(v1.8)[13]過(guò)濾宿主序列，將有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

使用MegaHit（v1.1.2）對(duì)上述有效數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，通過(guò)MetaGeneMake（v2.1.0）[14]對(duì)組裝序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）預(yù)測(cè)。使用CD-HIT（v4.7）[15]將相似度在95%以上且比對(duì)區(qū)域大于90 %的序列聚類(lèi)為一個(gè)單元，以去除重復(fù)的冗余序列，構(gòu)建樣品非冗余基因集（Unigene Catalog）。使用Bowite2（v1.2.2）[16]將樣品的高質(zhì)量序列與基因集比對(duì)，采用Pathoscope（v1.0）[17]將序列重新分配至“最可能來(lái)源”的基因。

使用DIAMOND（v0.8.3.6）[18]將編碼基因映射至NR 數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-redundant Protein Sequences from GenPept,Swissprot,PIR,PDF,PDB,and NCBI RefSeq）和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes），獲得相應(yīng)基因的注釋信息?；贜R 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，使用MEGAN（v6）[19]進(jìn)行微生物物種信息注釋?zhuān)⒂?jì)算該物種的豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

黑曲、黃曲、白曲高溫大曲樣品中提取的DNA經(jīng)宏基因組測(cè)序，共獲得693,414,364 條序列（77,046,040±3,473,586 條，Mean±SD，n=9），合計(jì)104.7 Gbp 的原始數(shù)據(jù)，其中97.5 %的序列為高質(zhì)量序列，共計(jì)101.7 Gbp。高質(zhì)量序列經(jīng)過(guò)Megahit 軟件單拼共得1,060,673 條重疊群序列（Contigs），經(jīng)過(guò)MetaGene 軟件共預(yù)測(cè)得1,649,504 個(gè)開(kāi)放閱讀框，經(jīng)CD-HIT 軟件聚類(lèi)得714,190 個(gè)基因組成的非冗余基因集，基因平均長(zhǎng)度為492 bp，表明測(cè)序質(zhì)量可以用來(lái)表征3種高溫大曲樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)與差異分析

非冗余基因集中共有501,795 個(gè)基因（70.3 %）在NCBI NR（v 20200604）數(shù)據(jù)庫(kù)中具有明確的物種注釋信息，分布于467 個(gè)目（Order）、2071 個(gè)屬（Genus）中。主坐標(biāo)分析顯示（圖1A），黑曲和黃曲的微生物群落結(jié)構(gòu)相近，在PCoA 1 軸上無(wú)法區(qū)分兩者，且均與白曲差異明顯。ANOSIM 相似性分析（圖1B）也顯示3種高溫大曲微生物群落組成差異顯著（R=0.74，P=0.002），這種差異反映出造成它們理化性質(zhì)、酶活、代謝物等方面差異的微生物基礎(chǔ)[20-21]。

黑曲、黃曲中微生物群落以真菌為主，真菌屬累計(jì)相對(duì)豐度分別為93.9 %、96.3 %，羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、曲霉屬（Aspergillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、籃狀菌屬（Talaromyces）、青霉菌屬（Penicillium）為優(yōu)勢(shì)真菌，均屬于散囊菌目，在兩者中的相對(duì)豐度分別為72.8 %和80.1 %。黑曲中絲衣霉屬（Byssochlamys）相對(duì)豐度顯著高于黃曲（T檢驗(yàn)，P＜0.05），黃曲中籃狀菌屬（Talaromyces）、青霉菌屬（Penicillium）相對(duì)豐度顯著高于黑曲。黑曲和黃曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，相對(duì)豐度極低，優(yōu)勢(shì)高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）相對(duì)豐度僅2.0 %左右；黑曲中鏈孢子菌屬（Desmospora）相對(duì)豐度顯著高于黃曲，其他細(xì)菌屬相對(duì)豐度無(wú)顯著差異（T 檢驗(yàn)，P＞0.05）。

白曲中微生物群落以細(xì)菌為主，細(xì)菌屬累計(jì)相對(duì)豐度達(dá)66.6 %，真菌屬相對(duì)豐度僅33.3 %（圖1C和圖1D）。白曲中以克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia，相對(duì)豐度19.6%）、鏈孢子菌屬（Desmospora，相對(duì)豐度10.7 %）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus，相對(duì)豐度8.5 %）、芽孢桿菌屬（Bacillus，相對(duì)豐度3.5 %）等細(xì)菌為主，相對(duì)豐度普遍高于黑曲和黃曲。對(duì)于真菌群落結(jié)構(gòu)，白曲中羅薩氏菌屬、曲霉屬、絲衣霉屬、籃狀菌屬、青霉菌屬的相對(duì)豐度累計(jì)為21.1 %，顯著低于黑曲和黃曲。值得注意的是，白曲中橫梗霉屬（Lichtheimia，相對(duì)豐度1.9 %）、根霉屬（Rhizopus，2.5 %）相對(duì)豐度明顯高于黑曲、黃曲，且兩者均屬于毛霉目（Mucorales）。上述研究結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道相一致[22-24]。

圖1 高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步探究了不同高溫大曲的標(biāo)志性微生物，采用相對(duì)豐度排名前二十的微生物屬進(jìn)行線性判別分析（Linear Discriminant Analysis-Effect Size，LEfSe）（圖1E）。結(jié)果顯示，黑曲的標(biāo)志性微生物為曲霉屬，黃曲的標(biāo)志性微生物為青霉菌屬和散囊菌目等，白曲的標(biāo)志性微生物包括克羅彭施泰特氏菌屬、鏈孢子菌屬和芽孢桿菌屬。表明黑曲和黃曲之間的差異主要?dú)w結(jié)于真菌群落組成的異質(zhì)性，白曲中更加豐富多樣的細(xì)菌群落使其明顯區(qū)別于黑曲和黃曲。

2.3 基于CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)的碳水化合物活性酶組成與差異分析

非冗余基因集中共有11,825 條基因（1.7 %）在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（Carbohydrate-active En‐zymes Database，CAZy）中具有明確的功能注釋信息，共計(jì)395 個(gè)碳水化合物活性酶，包括208 個(gè)糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），73 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl Transferases，GTs），44 個(gè)多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），15 個(gè)碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），31 個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs），24個(gè)輔助氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）。如圖2A 所示，黑曲和黃曲中碳水化合物活性酶基因累計(jì)豐度分別為17,333.3 和16,830.0（TPM），顯著低于白曲（TPM：18,384.8）（圖2A）。

如圖2B 所示，GHs 是高溫大曲中種類(lèi)最多、基因豐度最高的碳水化合物活性酶類(lèi)[25]，黑曲、黃曲和白曲中的GHs 基因豐度依次降低，可能造成三者中還原糖含量、高溫條件下的美拉德反應(yīng)和褐變反應(yīng)存在差異，進(jìn)而形成3種高溫大曲的顏色差異。根據(jù)GHs 基因的物種貢獻(xiàn)度信息，黑曲和黃曲的GHs 主要源于羅薩氏菌屬、絲衣霉屬、曲霉屬等，后者中的GHs 基因還來(lái)源于籃狀菌屬、嗜熱真菌屬等。黑曲和黃曲中絕大部分GHs 基因源于散囊菌目真菌，白曲中的GH 基因源于芽孢桿菌目（Bacil‐lales）和散囊菌目，其中，芽孢桿菌目主要包括鏈孢子菌屬、克羅彭施泰特氏菌屬、枝芽孢菌屬等。同GHs 基因相似，黑曲和黃曲中的AAs 基因也主要源于散囊菌目真菌，白曲中的AAs 基因源于芽孢桿菌目和散囊菌目。

圖2 高溫大曲碳水化合物活性酶組成

圖3 高溫大曲微生物群落的代謝功能差異

黑曲、黃曲和白曲中的GTs 基因豐度較高，隨著大曲顏色變淺，GTs 基因豐度升高。黑曲和黃曲中的GTs 基因主要來(lái)源于羅薩氏菌屬、籃狀菌屬、絲衣霉屬、曲霉屬等，白曲中主要源自克羅彭施泰特氏菌屬、鏈孢子菌屬、枝芽孢桿菌屬等細(xì)菌。相對(duì)豐度最高的克羅彭施泰特氏菌屬、鏈孢子菌屬、枝芽孢菌屬等細(xì)菌也使得白曲中CEs 和PLs 基因豐度高。白曲中較高豐度的GTs、CEs、PLs 基因可能是其糖化力、液化力、酯化力比黑曲和黃曲高的原因之一。

2.4 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的微生物群落功能組成與差異分析

非冗余基因集中共有193,772 條基因（27.1%）在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（v 94.2）中具有明確的功能注釋信息，共計(jì)10006 個(gè)KO（KEGG Orthology）。將這些KO 映射到與微生物活動(dòng)相關(guān)的途徑（KEGG Path‐way），即代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genet‐ic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environ‐mental Information Processing）、細(xì)胞過(guò)程（Cellular Processes）。與碳水化合物活性酶總基因豐度類(lèi)似，隨著高溫大曲顏色變淺，KEGG 途徑的總TPM基因豐度依次升高。

基于KEGG Pathway Level 1（L1）、Level 2（L2）基因豐度的LEfSe 分析如圖3A 所示。黑曲的標(biāo)志性微生物活動(dòng)途徑為異源物生物代謝和降解（Xe‐nobiotics Biodegradation and Metabolism），微生物群落可能代謝更多的異源物質(zhì)，產(chǎn)生多種代謝物，并有助于提升黑曲的香氣濃郁度。黃曲的標(biāo)志性微生物活動(dòng)途徑為遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程（L1），黃曲中與基因、環(huán)境信息處理相關(guān)的代謝活動(dòng)較為旺盛。白曲的標(biāo)志性微生物活動(dòng)途徑為氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成（Biosynthesis of Other Second‐ary Metabolites）等。

進(jìn)一步基于KEGG Pathway L2、Level 3（L3）基因豐度的LEfSe 分析如圖3B 所示。黑曲中與能量代謝（Energy Metabolism）相關(guān)的氧化磷酸化途徑基因豐度最高，主要源于曲霉屬、籃狀菌屬等真菌（圖3C），推測(cè)黑曲中的能量代謝活動(dòng)最為旺盛，釋放大量的生物熱，使黑曲擁有更高的發(fā)酵溫度。黑曲中的標(biāo)志性代謝途徑也包括異源物生物代謝和降解（L2）的10 個(gè)L3 途徑，基因主要源于絲衣霉屬、羅薩氏菌屬、曲霉屬等真菌，涉及大量的芳香族化合物代謝，表明此類(lèi)絲狀真菌可能促進(jìn)黑曲中芳香族化合物的積累。黃曲的標(biāo)志性代謝途徑主要是脂質(zhì)代謝（Lipid Metabolism）、聚糖的生物合成與代謝（Glycan Biosynthesis and Metabolism），主要為羅薩氏菌屬、籃狀菌屬等真菌的功能活性。

白曲中絲狀真菌相對(duì)豐度較低，其能量代謝、異源物生物代謝和降解、脂質(zhì)代謝、聚糖的生物合成與代謝下的L3 途徑等的基因豐度低于黑曲和黃曲，可能導(dǎo)致白曲的代謝活力較低，進(jìn)而使白曲的發(fā)酵溫度和香氣濃郁度較低。白曲的標(biāo)志性代謝途徑主要分布于碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代謝、核苷酸代謝（Nucleotide Metabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of Cofactors and Vitamins），相關(guān)基因主要源于克羅彭施泰特氏菌屬、枝芽孢菌屬、鏈孢子菌屬等細(xì)菌。

綜上所述，黑曲和黃曲的優(yōu)勢(shì)微生物主要為多種絲狀真菌，其參與次級(jí)代謝的能力較強(qiáng)，可能有利于提高醬香型白酒風(fēng)味的多樣性和豐富度。黃曲的微生物群落具有較強(qiáng)參與遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程的能力，說(shuō)明黃曲微生物群落可能具有良好的適應(yīng)能力，新建窖池試生產(chǎn)、酒醅發(fā)酵異常時(shí)可作為通用高溫大曲使用。白曲中大量存在的細(xì)菌群落能廣泛參與基礎(chǔ)代謝，比如丙酮酸代謝（Pyruvate Metabolism）、三羧酸循環(huán)（Citrate Cycle）等，因此，在醬香型白酒堆積發(fā)酵階段，可適當(dāng)提高高溫大曲中白曲的比例，利用白曲中豐富的細(xì)菌群落以及更高的液化力、糖化力，加速微生物基礎(chǔ)代謝水平，縮短堆積時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用宏基因組學(xué)深入分析了黑曲、黃曲和白曲的微生物群落與潛在功能的差異。研究結(jié)果表明，黑曲和黃曲中優(yōu)勢(shì)微生物均屬于散囊菌目，黑曲中主要以羅薩氏菌屬、曲霉屬、絲衣霉屬等真菌為主，這些真菌擁有較多的GHs、AAs 基因以及與能量代謝、異源物生物代謝和降解相關(guān)的生物酶基因；黃曲中主要以羅薩氏菌屬、籃狀菌屬、曲霉屬等真菌為主，它們攜帶較多的GHs、GTs，以及與脂質(zhì)代謝、聚糖合成和代謝等相關(guān)的生物酶基因；白曲中主要以芽孢桿菌目細(xì)菌為主，如克羅彭施泰特氏菌屬、鏈孢子菌屬、枝芽孢菌屬、芽孢桿菌屬等，這些細(xì)菌含有較多的GTs、CEs、PLs 基因，可能使白曲擁有較高的糖化力、液化力、酯化力。此外，芽孢桿菌目細(xì)菌還具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝以及代謝輔助因子和維生素的能力。本文進(jìn)一步明確了高溫大曲微生物群落與功能組成的異質(zhì)性，為不同類(lèi)型高溫大曲的工藝研究及應(yīng)用場(chǎng)景提供了參考。