何金明,孫智禹,牛慶生,劉玉玲,徐 凱

(吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所,吉林 132108)

蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)是生命體的主要組成物質(zhì),在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖方面發(fā)揮著重要的作用。相較于昆蟲的個(gè)體基本生存需求,其在繁殖階段對(duì)蛋白質(zhì)和脂類的需求更大。關(guān)于動(dòng)物的飼養(yǎng)試驗(yàn)表明,日糧中添加氨基酸和脂類可提高昆蟲的繁殖能力(徐暢等, 2019)。棉象鼻蟲Elaeidobiuskamerunicus的人工飼料中必須添加氨基酸才能保障其正常發(fā)育和產(chǎn)卵(曾凡榮, 2018)。在桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis和昆士蘭實(shí)蠅Bactroceratryoni的日糧中添加脂肪酸能夠提高其羽化率、產(chǎn)卵量和卵孵化率(Changetal., 2010; Moadelietal., 2018)。此外,昆蟲的不同生理階段體內(nèi)氨基酸和脂肪酸含量也會(huì)發(fā)生一定變化。如黑胸大蠊Periplanetafuliginosa在若蟲期和卵期的氨基酸含量存在較大差異(吳仕筠等, 2008)。黃褐油葫蘆Teleogryllusderelictus蟲體的脂肪酸含量隨著生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸增加,且其在不同階段(高齡若蟲、卵與低齡若蟲)間存在顯著差異(史樹森等, 2005)。比較昆蟲不同繁殖階段體內(nèi)氨基酸和脂肪酸含量的差異,對(duì)探究昆蟲繁殖相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝機(jī)制具有重要意義。

熊蜂Bombusspp.是多種野生植物和農(nóng)作物重要的傳粉昆蟲,在維護(hù)生態(tài)平衡和促進(jìn)農(nóng)業(yè)增收方面發(fā)揮著重要作用(Arango-Diagoetal., 2020)。野生的熊蜂多為一年一個(gè)世代,其在早春時(shí)期結(jié)束冬眠后開始產(chǎn)卵,逐漸進(jìn)入繁殖階段,子代蜂王交尾后會(huì)離群尋找新的越冬場(chǎng)地,而原群則在秋末迅速滅亡。野生熊蜂僅能為春末和夏季的作物進(jìn)行授粉,為滿足冬季和早春設(shè)施作物的授粉需求,則必須通過(guò)工廠化繁育來(lái)打破其固有的繁育周期,實(shí)現(xiàn)周年繁育,繼而實(shí)現(xiàn)規(guī)?；曫B(yǎng)。熊蜂工廠化繁育主要包括了滯育、產(chǎn)卵、成群、子代繁育等重要環(huán)節(jié),其中成群率低是制約我國(guó)實(shí)現(xiàn)本土熊蜂工廠化繁育的主要原因之一。成群是熊蜂從獨(dú)居性向社會(huì)性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期。許多研究將蜂王培育出10頭以上工蜂的蜂群定義為成群,表示該蜂群具有鮮明的社會(huì)分工,而到期卻未培育出10頭工蜂便停產(chǎn)的蜂群則被定義為未成群(Gosterit, 2016)。影響熊蜂成群的因素主要包括品種特性、營(yíng)養(yǎng)代謝、飼養(yǎng)環(huán)境以及繁育方法等。但在熊蜂工廠化繁育中,繁育蜂種、飼養(yǎng)環(huán)境和繁育方法相對(duì)一致,蜂王體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝則成為決定熊蜂成群的主要因素。目前關(guān)于昆蟲不同繁殖階段生理指標(biāo)測(cè)定的研究較少,更未見熊蜂成群階段蜂王體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定熊蜂成群與未成群蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸種類及含量,探究?jī)蓚€(gè)不同繁殖狀態(tài)下蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸含量的差異,以期闡釋氨基酸和脂肪酸代謝對(duì)熊蜂成群的影響,并為工廠化繁育中熊蜂蜂王各繁育階段精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)日糧的配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用熊蜂均為吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所熊蜂擴(kuò)繁基地的明亮熊蜂Bombuslucorum,采集的蜂王樣本均為同一批次,且飼養(yǎng)環(huán)境和繁育方法完全相同。蜂王產(chǎn)卵40 d后在飼養(yǎng)室中分別隨機(jī)選取成群蜂群(工蜂數(shù)量>10頭)的蜂王和未成群蜂群(工蜂數(shù)量<10頭)的蜂王各30頭,隨機(jī)分為3組(10頭/組)。采集后的蜂王經(jīng)編號(hào)后立即投入液氮中,隨后保存于-80℃冰箱,用于后續(xù)氨基酸和脂肪酸含量的測(cè)定。

1.2 主要試劑與儀器

17種氨基酸標(biāo)品均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;乙腈、異硫氰酸苯酯、正己烷、三氟化硼甲醇均購(gòu)自CNW;乙醚、石油醚、三乙胺等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;35種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

電子天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司(型號(hào):舜宇恒平FA-1004)、離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司(型號(hào):BR4I)、液相色譜儀購(gòu)自Aglient公司(型號(hào):1260)、氣相色譜儀質(zhì)譜儀購(gòu)自Thermo公司(型號(hào):Trace1310 ISQ)。

1.3 不同繁殖狀態(tài)下熊蜂氨基酸、脂肪酸含量測(cè)定方法

分別對(duì)每個(gè)組的10頭熊蜂蜂王樣品進(jìn)行混合研磨,并利用高效液相色譜法(HPLC法)和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)對(duì)熊蜂蜂王體內(nèi)各氨基酸含量和脂肪酸含量分別進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定樣品氨基酸組成及含量時(shí),使用20 mL 1∶1 HCL對(duì)樣品進(jìn)行前處理,110℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中水解22 h,冷卻后定容至25 mL。取50 μL樣品放入真空干燥箱中60℃干燥2 h后在離心管中充氮,加入50 μL衍生試劑后室溫衍生30 min,加入流動(dòng)相A 4.5 mL后混勻,過(guò)0.45 μm有機(jī)膜上機(jī)。

在測(cè)定樣品脂肪酸組成及含量時(shí),稱量適量樣品水解后提取脂肪,于100℃烘箱中干燥2 h。向脂肪提取物中加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液,85℃水浴30 min,加入3 mL 14% 三氟化硼甲醇溶液,85℃水浴30 min。水浴完成后,溫度降至室溫后加入1 mL正己烷,震蕩萃取2 min,靜置1 h。取上層清液100 μL,用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm濾膜過(guò)膜后上機(jī)測(cè)試。

樣品測(cè)定由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析,并選用Tukey法進(jìn)行多重比較,最終氨基酸和脂肪酸含量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 成群與未成群熊蜂蜂王體內(nèi)氨基酸差異

2.1.1氨基酸組成

對(duì)熊蜂成群與未成群蜂王體內(nèi)氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定,在待檢測(cè)的17種水解氨基酸中只檢測(cè)到16種氨基酸,未檢測(cè)出蛋氨酸(圖1)。成群和未成群蜂王體內(nèi)含量最多的6種氨基酸均為谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸,且以上6種氨基酸含量總和超過(guò)了蜂王氨基酸總和的50%。在成群蜂王體內(nèi)含量由高到低依次為谷氨酸>丙氨酸>亮氨酸>絲氨酸>天冬氨酸>蘇氨酸,但在未成群蜂王體內(nèi)由高到低依次為谷氨酸>亮氨酸>丙氨酸>天冬氨酸>絲氨酸>蘇氨酸。

圖1 熊蜂成群(A)與未成群(B)蜂王體內(nèi)氨基酸組成Fig.1 Amino acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)

2.1.2氨基酸含量

對(duì)成群和未成群熊蜂蜂王體內(nèi)氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表1。成群與未成群階段熊蜂蜂王體內(nèi)13種氨基酸含量存在顯著差異,分別為天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絡(luò)氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸。在13種氨基酸中,除丙氨酸外,成群蜂王體內(nèi)其他氨基酸的含量均顯著低于未成群蜂王(P<0.05)。經(jīng)過(guò)比較不同生理階段熊蜂蜂王體內(nèi)各氨基酸含量的差異幅度可發(fā)現(xiàn),蜂王體內(nèi)纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸的變化幅度最大,均高于14%。

表1 成群蜂王與未成群蜂王體內(nèi)氨基酸含量比較

2.2 成群與未成群熊蜂蜂王體內(nèi)脂肪酸差異

2.2.1脂肪酸組成

在待檢測(cè)的35種脂肪酸中蜂王體內(nèi)僅檢測(cè)到17種脂肪酸,油酸C18∶1n9c、α-亞油酸C18∶3n3和亞油酸C18∶2n6c為蜂王占比最多的3種脂肪酸(圖2)。脂肪酸根據(jù)碳?xì)滏溨酗柡统潭?可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)。在熊蜂成群蜂王體內(nèi)SFA、MUFA和PUFA的占比分別為14.16%、36.50%和49.34%。而在未成群蜂王體內(nèi)SFA、MUFA和PUFA的占比分別為17.91%、39.66%和42.43%。

2.2.2脂肪酸含量

成群和未成群熊蜂蜂王體內(nèi)脂肪酸含量見表2。成群與未成群階段熊蜂蜂王體內(nèi)6種脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05),分別為辛酸、癸酸、月桂酸、亞油酸、順-11-二十烯酸、二十三酸。在6種脂肪酸中,未成群蜂王體內(nèi)辛酸、癸酸、月桂酸的含量顯著高于成群蜂王,而成群蜂王體內(nèi)亞油酸、順-11-二十烯酸、二十三酸顯著高于未成群蜂王。經(jīng)過(guò)比較不同蜂王體內(nèi)飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量可發(fā)現(xiàn),成群蜂王體內(nèi)多不飽和脂肪酸含量顯著高于未成群蜂王(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

熊蜂屬于亞社會(huì)性昆蟲,其蜂王滯育結(jié)束后獨(dú)自進(jìn)行產(chǎn)卵和哺育幼蟲,至第一批工蜂(數(shù)量為8～16頭)羽化出房后,蜂王專職產(chǎn)卵,工蜂進(jìn)行哺育和采集等活動(dòng)(Goulson, 2009)。當(dāng)蜂群內(nèi)工蜂數(shù)量超過(guò)10頭時(shí),該蜂群進(jìn)入成群階段。成群意味著該蜂群完成了從獨(dú)居性向社會(huì)性的轉(zhuǎn)變,也是后續(xù)群勢(shì)增長(zhǎng)、子代繁衍以及為作物授粉的前提條件。到一定時(shí)間后群勢(shì)仍未達(dá)到10頭工蜂的蜂群通常定義為未成群,熊蜂工廠化繁育中未成群的原因通常是由于蜂王的產(chǎn)卵能力和哺育能力較低所導(dǎo)致的(徐凱等, 2020)。本研究比較成群和未成群蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)成群和未成群蜂王體內(nèi)各氨基酸和脂肪酸含量占比均存在較大差異,推測(cè)蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸的代謝參與了熊蜂產(chǎn)卵、哺育等生殖活動(dòng),與Ghosh等研究結(jié)果相近(Ghoshetal., 2017)。

圖2 熊蜂成群(A)與未成群(B)蜂王體內(nèi)脂肪酸組成Fig.2 Fatty acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)注:SFA,飽和脂肪酸;MUFA,單不飽和脂肪酸;PUFA,多不飽和脂肪酸。Note: SFA, Saturated fatty acids; MUFA, Monounsaturated fatty acids; PUFA, Polyunsaturated fatty acids.

表2 成群蜂王與未成群蜂王體內(nèi)脂肪酸含量

氨基酸和脂肪酸分別作為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的基本組成單位,在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、生殖繁衍以及適應(yīng)環(huán)境等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Simpsonetal., 2012; 龍登隆等, 2021)。已有研究表明,一些功能性氨基酸和脂肪酸會(huì)影響動(dòng)物的性腺發(fā)育、精卵質(zhì)量、胚胎發(fā)育等繁殖性能(Wu, 2009; Zakerietal., 2011)。Hoedjes等(2017)研究表明日糧中功能性氨基酸對(duì)果蠅的壽命和生殖能力有直接影響。李興鵬等(2018)發(fā)現(xiàn)提高蠋蝽Armachinensis日糧中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有助于4～5齡若蟲生長(zhǎng),并提升其成蟲的生殖能力。Ling等(2007)提高日糧中亞麻酸和亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,果蠅的羽化率、產(chǎn)卵量和卵孵化率顯著增加。本研究在熊蜂蜂王體內(nèi)分別檢測(cè)到16種氨基酸和17種脂肪酸,經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),在成群和未成群蜂王體內(nèi)分別有13種氨基酸和6種脂肪酸含量存在顯著差異,推測(cè)蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸參與了熊蜂的成群過(guò)程,與上述研究結(jié)果相一致。

氨基酸是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖所必須的營(yíng)養(yǎng)元素,除了一些蚜蟲等刺吸式口器的昆蟲外,大多數(shù)昆蟲均先將蛋白質(zhì)水解為氨基酸后由蟲體細(xì)胞吸收、循環(huán),并再次合成肌肉、細(xì)胞膜、酶以及一些特殊的激素等需要的蛋白質(zhì)(張楊等, 2021)。在果蠅的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),日糧中蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等必需氨基酸的添加能夠有效延長(zhǎng)果蠅的壽命,并提高其繁殖力(Hoedjesetal., 2017)。Ghosh等(2017)比較熊蜂Bombusterrestris滯育期體內(nèi)氨基酸含量后發(fā)現(xiàn),熊蜂滯育前后蜂王體內(nèi)賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸的含量降低,其余氨基酸含量上調(diào)。本研究中發(fā)現(xiàn),熊蜂成群和未成群蜂王體內(nèi)13種氨基酸含量存在顯著差異,且除丙氨酸外,其余氨基酸均為顯著下降,且纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸下降幅度較大。李方方等(2013)研究表明,日糧中的纈氨酸與賴氨酸可提高初產(chǎn)母豬的日采食量和產(chǎn)仔性能。陳熠等(2009)研究表明纈氨酸對(duì)泌乳母豬體內(nèi)激素水平具有一定影響。Wu等(2005)對(duì)妊娠不同時(shí)期的母豬及胎兒液檢測(cè)后分析發(fā)現(xiàn)妊娠母豬體內(nèi)脯氨酸含量與胎盤發(fā)育速度存在相關(guān)性。Kazuchika等(2014)研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育以及胚胎發(fā)育具有直接影響。成群蜂王體內(nèi)纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸的大幅下降,推測(cè)熊蜂成群與蜂王采食量、卵母細(xì)胞發(fā)育、生殖激素分泌以及產(chǎn)卵性能密切相關(guān)。

脂肪酸是一類一端含有一個(gè)羧基的脂肪族碳?xì)滏?參與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、激素分泌、生殖和抗寒等多項(xiàng)生理活動(dòng)(鄭天祥等, 2017)。脂肪酸一般分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。研究表明,多不飽和脂肪酸通過(guò)合成類固醇激素進(jìn)而影響動(dòng)物的繁殖性能,不僅可以促進(jìn)動(dòng)物生殖器官的發(fā)育,還可以提高其排卵率和產(chǎn)仔率(王懷禹, 2011)。本研究中成群階段蜂王體內(nèi)多不飽和脂肪酸顯著高于未成群蜂王,推測(cè)多不飽和脂肪酸在提高蜂王卵巢功能和促進(jìn)產(chǎn)卵方面發(fā)揮著重要作用(Vrabliketal., 2013)。辛酸C8∶0、癸酸C10∶0和月桂酸C12∶0均屬于中鏈脂肪酸,比長(zhǎng)鏈脂肪酸更易被動(dòng)物吸收,具有迅速供能作用。本研究發(fā)現(xiàn)成群蜂王體內(nèi)辛酸、癸酸和月桂酸均顯著低于未成群蜂王,推測(cè)在熊蜂成群過(guò)程中大量的中鏈脂肪酸被腸道所吸收,用以產(chǎn)卵和哺育幼蟲時(shí)的部分能量來(lái)源(袁愛雲(yún), 2021)。此外,中鏈脂肪酸還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道形態(tài)、抑制有害菌增殖、調(diào)節(jié)免疫功能以及促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能等功能,蜂王體內(nèi)中鏈脂肪酸的代謝也可增強(qiáng)蜂王免疫能力,利于熊蜂成群(Sundqvistetal., 2018)。吳洪號(hào)等(2021)研究表明ω-6(包含亞油酸)類脂肪酸能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素和催乳素的分泌。Holman等(2019)對(duì)社會(huì)性昆蟲蜂王信息素進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析后發(fā)現(xiàn)蜂王信息素合成相關(guān)基因富集于長(zhǎng)鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸合成的分子通路。此外,大量的研究也表明,長(zhǎng)鏈脂肪酸也是蜂王物質(zhì)表皮碳?xì)浠衔顲HCs的組成成分(Oldhametal., 2010)。本研究發(fā)現(xiàn)成群蜂王體內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸(C23∶0、C20∶1和C18∶2n6c)的含量顯著高于未成群蜂王,推測(cè)該3種脂肪酸在蜂王成群后機(jī)體合成蜂王物質(zhì)和信息素中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)果表明,熊蜂成群和未成群蜂王體內(nèi)氨基酸和脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05),熊蜂蜂王成群率低可能與蜂王體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類代謝異常有關(guān)?；诖搜芯拷Y(jié)果,在實(shí)際的熊蜂工廠化繁育過(guò)程中,應(yīng)挑選多種蛋白質(zhì)含量高、富含多不飽和脂肪酸的新鮮蜂花粉混合后飼喂蜂群,并根據(jù)蜂群的不同繁育階段調(diào)整蜂花粉種類配比,最大限度保證蜂王較高的繁殖性能,提高熊蜂成群率。