王 慧,趙一錚,黃慧敏,周志軍

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071002)

植物與植食性昆蟲占據(jù)地球半數(shù)以上物種種類(Futuyma and Agrawal, 2009),是陸生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成部分。綠色植物是生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生產(chǎn)者(McClenaghanetal., 2015),為昆蟲提供食物、躲避天敵和繁衍生息的場(chǎng)所(Loaizaetal., 2008)。植物的防御行為與昆蟲的取食密切相關(guān),植物進(jìn)化出種類繁多的次生代謝產(chǎn)物,對(duì)昆蟲的食物選擇產(chǎn)生重要影響。同時(shí),昆蟲也為植物運(yùn)輸種子和傳遞花粉,被子植物的多樣性被認(rèn)為與昆蟲的取食密切聯(lián)系。昆蟲形態(tài)及生活史變化可能是促使植物分化的重要?jiǎng)恿?Marquis, 2004)。正如Ehrlich和Raven提出的植食性昆蟲與植物的相互作用,造就了現(xiàn)今陸地生物多樣性的產(chǎn)生。植物含有植食性昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),包括碳水化合物、氨基酸、甾醇、磷脂、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素和水等(Chapman, 1998; Schoonhovenetal., 2005)。

常用的植食性昆蟲食性分析方法包括:取食行為直接觀察法和腸道內(nèi)容物及糞便顯微鑒定法。取食行為直接觀察法耗時(shí)費(fèi)力,只能對(duì)少量個(gè)體的取食情況進(jìn)行定性研究(Gordonetal., 1995);不適用于活動(dòng)范圍較廣、夜行性或警覺性較高的昆蟲(Barnettetal., 2010; Bakeretal., 2014);對(duì)那些復(fù)雜環(huán)境中存在多種空間上不分離的潛在被取食對(duì)象,很難準(zhǔn)確識(shí)別昆蟲取食的植物種類(Valentinietal., 2009)。鑒于上述缺陷,逐漸形成多種基于糞便或腸道內(nèi)容物的食性分析方法(Moreno-Black, 1978; Van, 2000; 劉剛等, 2018):(1)顯微鑒定法(Microhistological method),對(duì)糞便或腸道內(nèi)容物中的植物表皮碎片進(jìn)行形態(tài)學(xué)顯微鑒定,對(duì)研究者形態(tài)學(xué)專業(yè)知識(shí)要求較高(Holecheketal., 1982; Mclnnisetal., 1983),對(duì)形態(tài)相似的近緣種鑒定效率較低;(2)飽和烷烴指紋法(Alkane fingerprint method),根據(jù)每種植物獨(dú)特的飽和烷烴濃度模式,能較好地分析和預(yù)測(cè)動(dòng)物攝食量,但難以確定食物組成(Dove and Mayes, 1996);(3)近紅外反射光譜法(Near infrared spectroscopy, NIRS),通過(guò)掃描食性樣品的近紅外光譜得到食物的有機(jī)分子光譜特征,容易受顆粒大小和均勻性影響使分析結(jié)果產(chǎn)生偏差(Foleyetal., 1998; Kanekoetal., 2006)。上述幾種食性分析方法在進(jìn)行定量分析時(shí)均存在一定偏差。

近年來(lái),隨著植物DNA條形碼研究的深入,為有效鑒別植食性昆蟲取食的寄主植物種類、解析二者間的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系提供了新方法。目前,葉綠體matK、trnH-psbA以及rbcL組合被認(rèn)為是理想的植物DNA條形碼選擇。Symes等(2019)以matK、trnH-psbA和rbcLa3個(gè)基因片段對(duì)螽斯食性進(jìn)行了研究。DNA條形碼在植食性灶蟋Gryllodeshebraeus研究結(jié)果表明取食后12 h內(nèi)消化道中的食物均可被檢測(cè)到(Mathesonetal., 2008)。H?ss等(1992)首次將葉綠體rbcl基因片段用于植食性動(dòng)物食性分析。McClenaghan等(2015)利用葉綠體rbcLa基因片段比較了蝗科4種蝗蟲取食的植物種類。目前,葉綠體rbcL基因片段認(rèn)可度最高,GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄葉綠體rbcL基因序列287 752條(截止2021年11月1日);而BOLD(Barcode of Life Data System, http://www.boldsystems.org)數(shù)據(jù)庫(kù)則以葉綠體rbcL&matK序列作為植物分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)組合。

螽斯科是直翅目物種多樣性最高的科,作為鳴蟲具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)植食性螽斯取食的植物種類進(jìn)行鑒定,不僅有助于了解其在生物群落中的功能(Duffyetal., 2007),而且對(duì)于豐富植食性昆蟲-植物間的協(xié)同進(jìn)化理論具有重要意義。日本條螽Ducetiajaponica隸屬于直翅目Orthoptera螽斯科Tettigoniidae,廣泛分布于東洋界、澳洲界部分區(qū)域,在我國(guó)除西北部分地區(qū)外的多數(shù)地區(qū)均有分布(Ciglianoetal., 2021)。日本條螽存在棕色和綠色兩種色型,在野外常見于低矮喬木、灌木、草叢,在城區(qū)綠地大量發(fā)生。白天多隱藏在植物葉片背面或草叢中,傍晚爬至灌木上取食。Suetsugu和Tanaka(2014)發(fā)現(xiàn)日本條螽若蟲頻繁訪問(wèn)并取食蘭科Habenariasagittifera花粉和花藥帽,認(rèn)為可能存在直翅目-蘭花授粉互惠共生的進(jìn)化途徑。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)日本條螽的鳴聲特征(楊培林等, 2000; 石福明等, 2003; Helleretal., 2017)、線粒體基因組序列(劉菲, 2017)、種群遺傳結(jié)構(gòu)及譜系地理學(xué)(Zhouetal., 2021)進(jìn)行了研究。為探明造就日本條螽地理分布格局及其能夠在城區(qū)綠地大量存在的原因,本研究利用葉綠體rbcLa基因片段對(duì)城區(qū)綠地和城郊荒地兩種生境中取食的植物種類進(jìn)行了分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與腸道內(nèi)容物DNA提取

本研究所用日本條螽標(biāo)本于2021年8-9月夜晚(20∶00-22∶00)采集自河北保定城區(qū)軍校廣場(chǎng)、河北大學(xué)五四路校區(qū)、馬莊荒地(圖1)。采集到的日本條螽標(biāo)本立即置于盛有足量無(wú)水酒精的凍存管中帶回實(shí)驗(yàn)室。次日上午縱向剪開日本條螽腹壁,輕拉頭部取出完整消化道?？v向剪開消化道壁,收集內(nèi)容物并在液氮中充分研磨。使用TIANGEN新型植物基因組提取試劑盒(DP320),依據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行DNA提取,并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 日本條螽生境圖Fig.1 Habitus of Ducetia japonica 注:A,城區(qū)綠地;B,城郊荒地;C,夜晚采集標(biāo)本照;D,標(biāo)本生態(tài)照。Note: A, Urban green space; B, Suburban wasteland; C, Collecting specimen photos at night; D, Specimen ecological photos.

1.2 葉綠體 rbcLa 基因片段PCR擴(kuò)增及測(cè)序

葉綠體rbcLa基因片段的擴(kuò)增引物為:rbcLa-F(ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC)和rbcLa-R(GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG)(Symesetal., 2019)。PCR反應(yīng)體系包括:2×Premix TaqTM25 μL、上下游引物各5 μL、DNA模板3 μL、超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送金唯智公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 測(cè)序結(jié)果拼接與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定

雙向測(cè)序結(jié)果使用DNAstar軟件包中的SeqMan拼接。通過(guò)BOLD、Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索,以確定每個(gè)日本條螽樣本取食的植物種類。本研究最佳匹配序列與目標(biāo)序列覆蓋度(Coverage)和一致度(Identity)均大于95%時(shí)認(rèn)為檢索結(jié)果有效。鑒定原則參考邵昕寧等(2019)修改如下:(1)當(dāng)BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)最佳匹配結(jié)果一致,且與單一物種比對(duì)一致度≥99%時(shí),記為該物種;與多個(gè)物種比對(duì)一致度均≥99%時(shí),記為涵蓋這些物種的最低分類單元。(2)比對(duì)一致度介于95%與99%之間,且符合物種分布記錄時(shí),同樣記為該物種。(3)比對(duì)一致度介于95%與99%之間,但僅對(duì)應(yīng)單一無(wú)分布記錄的物種;或比對(duì)一致度<95%時(shí),認(rèn)為無(wú)法確定具體種類,記為屬級(jí)未定種。(4)當(dāng)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)最佳匹配結(jié)果不一致時(shí),首先根據(jù)采集點(diǎn)本底信息及物種分布記錄排除不符合物種;如果仍無(wú)法排除則記為涵蓋這些物種的最低分類單元。將軍校廣場(chǎng)和河北大學(xué)校園歸為城區(qū)綠地,馬莊歸為城郊荒地兩種生境進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本條螽在城區(qū)綠地中取食的植物種類

從38頭采自城區(qū)綠地的日本條螽腸道內(nèi)容物中成功擴(kuò)增并測(cè)得葉綠體rbcLa基因序列,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)日本條螽在城區(qū)綠地中取食的植物種類涵蓋6科7種,以18頭取食衛(wèi)矛科Celastraceae的冬青衛(wèi)矛Euonymusjaponicus占據(jù)優(yōu)勢(shì)(47.37%)。其余20個(gè)個(gè)體由多至少依次為:茜草科Rubiaceae的茜草Rubiacordifolia(7頭),夾竹桃科Apocynaceae的鵝絨藤Cynanchumchinense(5頭),茜草科Rubiaceae的雞矢藤Paederiascandens(3頭),木樨科Oleaceae的迎春花Jasminumnudiflorum(2頭),大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens(2頭),薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa植物(1頭)(表1,圖2)。

2.2 日本條螽在城郊荒地中取食的植物種類

從37頭采自城郊荒地的日本條螽腸道內(nèi)容物中成功擴(kuò)增并測(cè)得葉綠體rbcLa基因序列,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)日本條螽在城郊荒地中取食的植物種類涵蓋5科6種,以30頭取食大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(81.08%)。其余7個(gè)個(gè)體由多至少依次為:唇形科Labiatae的紫蘇Perillafrutescens(3頭),葫蘆科Cucurbitaceae的南瓜Cucurbitamoschata(1頭)和絲瓜Luffaaegyptiaca(1頭),菊科Compositae的向日葵Helianthusannuus(1頭),黎科Chenopodiaceae的黎Chenopodiumalbum(1頭)(表2,圖2)。

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

表2 城郊荒地中日本條螽取食的植物種類

續(xù)表2 Continued table 2

圖2 城區(qū)綠地(A)和城郊荒地(B)中日本條螽的食物構(gòu)成Fig.2 Diet composition of Ducetia japonica in urban green space (A) and suburban wasteland (B)

3 結(jié)論與討論

昆蟲食性分析時(shí)由糞便和腸道內(nèi)容物中提取的DNA均存在一定程度的降解,并含有PCR抑制劑影響擴(kuò)增和測(cè)序成功率(Bradleyetal., 2007)。Symes等(2019)研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)植物DNA條形碼片段(rbcLa、psbA和matK)在前半夜(23∶00-01∶00)捕獲的體型較小的螽斯中擴(kuò)增成功率較高;此外,螽斯腸道內(nèi)容物顏色與擴(kuò)增和測(cè)序成功率密切相關(guān):無(wú)色+黃色+綠色+黃褐色組的成功率>30%,無(wú)色組的成功率約60%,棕色+橙色+紅色+綠棕色組的成功率極低。日本條螽為中型螽斯,腸道內(nèi)容物為綠色。植食性動(dòng)物在不同的棲息環(huán)境中,其食物的可獲得性和多樣性存在明顯不同(Cristo’bal-Azkarateetal., 2007)。日本條螽在兩種生境中取食的植物種類有一定的選擇性,但也與食物的可獲得性有關(guān)。城郊荒地的植物物種多樣性遠(yuǎn)高于城區(qū)綠地,但其對(duì)取食植物的偏好更為明顯,81.08%的日本條螽個(gè)體取食大麻科的葎草。城區(qū)綠地中,除47.37%個(gè)體取食衛(wèi)矛科的冬青衛(wèi)矛外,取食其余6種植物的比例從2.63%至18.42%不等,偏好性并不明顯,可能是其適應(yīng)城區(qū)綠地植物組成的結(jié)果。最佳覓食理論認(rèn)為,動(dòng)物在食物資源減少時(shí),會(huì)逐步向泛食性轉(zhuǎn)變。

本研究通過(guò)對(duì)新采集的日本條螽腸道內(nèi)容物進(jìn)行DNA提取、rbcLa基因片段PCR擴(kuò)增及測(cè)序,通過(guò)在GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)日本條螽至少取食10科、13種植物。結(jié)果表明,基于腸道內(nèi)容物DNA進(jìn)行植物DNA條形碼rbcLa基因片段擴(kuò)增、測(cè)序,并利用GenBank、BOLD等公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源可以對(duì)植食性昆蟲取食的植物種類進(jìn)行快速鑒定和食性分析。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的部分序列可能存在序列、對(duì)應(yīng)物種信息錯(cuò)誤。植物DNA條形碼研究為利用BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行植食性昆蟲食性分析的效率和精度得到極大提升。同一條序列可能與多個(gè)物種高度匹配,在缺乏足夠的區(qū)域物種本底信息時(shí),只能將其歸類為包含這些物種的上一級(jí)分類單元。通過(guò)構(gòu)建本地潛在食源DNA條形碼rbcL序列數(shù)據(jù)庫(kù)可顯著提高食性分析時(shí)的分類精度。

昆蟲是城市生物多樣性的重要組成部分。探究城市化進(jìn)程對(duì)城區(qū)昆蟲多樣性的影響,有助于更好地保護(hù)昆蟲多樣性。日本條螽能夠占據(jù)廣泛的分布范圍,并在城區(qū)綠地大量發(fā)生,可能與其廣譜的取食對(duì)象密切相關(guān)。為避免競(jìng)爭(zhēng),同域分布的近緣種可能會(huì)進(jìn)化出不同的覓食策略,選擇不同的微生境或取食不同的食物?；谥参顳NA條形碼的食性研究,為探究行蹤隱秘的植食性螽斯與棲息地植物間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供了新的手段,有助于揭示近緣種的同域共存機(jī)制。