王康，智曉東，張玉強，張文景，王偉

骨性關節(jié)炎（OA）是老年人致殘的主要原因之一，而且隨著人口老齡化進程其發(fā)生率逐年升高[1-2]。近年來，人羊膜上皮細胞（hAECs）引起了廣泛關注，與其他類型的干細胞相比，hAECs 具有擴增能力更強、避免倫理爭論、低免疫原性和非致瘤性等優(yōu)勢[3-4]。目前已發(fā)現(xiàn)hAECs 在治療肝臟疾病、神經(jīng)損傷、皮膚瘢痕等領域取得了良好的效果，有望成為再生醫(yī)學中一種可靠的細胞來源[5]。JAK2/STAT3 信號通路可通過參與炎癥反應來調(diào)控細胞的代謝和更新，目前已證實該通路的激活對心肌細胞、肺上皮細胞、腸黏膜細胞均有保護作用[6-7]。本文通過將hAECs 移植至大鼠關節(jié)腔，其對OA軟骨的修復作用，并觀察JAK2/STAT3信號通路在修復過程中的激活情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 剖宮產(chǎn)后的羊膜樣本收集自2021年錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，獲得錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批準，產(chǎn)婦術前均簽署知情同意書。成年健康雄性200 ～300 g 的SD 大鼠30 只，購自錦州醫(yī)科大學動物中心，動物實驗獲得錦州醫(yī)科大學實驗動物倫理審查。

1.2 OA 模型的構建 采用改良Hulth 法建立大鼠OA 模型[8]，飼養(yǎng)8 周后進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組 將已造模成功的雄性SD大鼠隨機分為實驗組和陰性對照組，另設空白對照組（健康大鼠），各10 只。0.5%異氟烷輕度麻醉大鼠后，行膝關節(jié)腔內(nèi)注射。實驗組：注射100lDMEM-F12（含1×106個hAECs 細胞）；陰性對照組：注射100l的DMEMF12；空白對照組不做任何處理。飼養(yǎng)1 個月之后進行后續(xù)實驗。

1.4 hAECs的原代分離、純化、培養(yǎng)以及傳代 PBS洗滌羊膜組織，置于滅菌培養(yǎng)皿中。剪成3cm2左右，移至10cm 培養(yǎng)皿中。加入20ml 0.25%胰酶，37 ℃，1 200 r/min，消化10 min，將獲得的消化液棄去；加入20 ml 0.25%胰酶，1 200 r/min 消化40 min，加入培養(yǎng)基終止消化，收集消化液，用300 目細胞篩網(wǎng)濾過，重復3 次。收集每次獲得的過濾液，4 ℃，1 200 r/min離心10 min，棄上清，重懸沉淀，接種到培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，48 h 后首次換液，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，光鏡下觀察拍照。

1.5 免疫細胞化學鑒定hAECs 取第3 代hAECs，0.25%胰酶消化，接種于培養(yǎng)皿中，孵箱培養(yǎng)。24 h后PBS 洗滌，固定；通透，PBS 洗滌。封閉后，滴加一抗CK19 或Vimentin，4 ℃過夜，PBS 洗滌。滴加二抗，孵育1 h，PBS 洗滌。避光孵育5 min，PBS 洗滌；封片，鏡下觀察。

1.6 流式細胞儀鑒定hAECs 取第3 代hAECs，0.25%胰酶消化，分裝到1.5 ml EP 管中。1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入0.3%BSA 溶液，每管200l，室溫密封30 min，1 200 r/min 離心5 min。棄上清，加入小鼠抗人單克隆抗體分化簇CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4 ℃靜置20 min。PBS洗滌2 次，上流式細胞儀檢測細胞表型。

1.7 膝關節(jié)軟骨大體及組織化學染色觀察 取大鼠膝關節(jié)行大體觀察。制作切片染色10min，PBS 洗滌，分化15 s，見切片變紅，水洗2 min，甩干。返藍10 s，水洗2min，甩干。滴加伊紅染色液，染色45s。依次經(jīng)過梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.8 免疫組化染色檢測COL2、MMP和TIMP表達將石蠟切片加熱2h。脫蠟，自來水洗5min，將脫蠟后的切片置于檸檬酸鈉抗原修復液中，水浴50min。取出切片，PBS 清洗，加入COL2、MMP和TIMP 一抗，每張切片50l，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，PBS 洗滌。滴加二抗，室溫孵育1 h。以DAB 顯色液顯色，脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。

1.9 Masson 染色 取大鼠膝關節(jié)，制石蠟切片，脫蠟，鉻化。染核5 ～10 min。充分水洗，用麗春紅酸性復紅液5 ～10 min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3 ～5min。苯胺藍染5min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，脫水、二甲苯透明、封片，鏡下觀察拍照并記錄。

1.10 番紅固綠染色 取大鼠膝關節(jié)，制石蠟切片。脫蠟，自來水洗，固綠染色，自來水沖洗，至軟骨呈無色，分化液浸泡，自來水稍洗。番紅染色：切片入番紅染液15 ～30 s，脫水，透明封片，觀察拍照。

1.11 ELISA檢測炎癥因子含量 取凍存滑膜樣本加入PBS，充分研磨，4℃條件下，2000r/min，離心20min，收集上清液，同時取凍存血清樣本。細胞因子TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 分別按廠家說明書用ELISA 試劑盒檢測。

1.12 Western-bolt 檢測EGFR信號通路相關蛋白取大鼠膝關節(jié)軟骨組織，用Trizol 法提取蛋白質(zhì)，經(jīng)定量后取60g 蛋白質(zhì)，凝膠電泳，轉膜，滴加p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 一抗，4 ℃孵育過夜。滴加二抗，室溫孵育2 h。加入A、B 液（ECL 系統(tǒng)）后化學發(fā)光，使用Quantity One 分析軟件進行蛋白條帶的定量分析。

1.13 統(tǒng)計方法 使用Image J 和SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，3 組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 檢驗或NewmaneKeuls 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hAECs 的特征鑒定 接種后2 d 內(nèi)，細胞黏附在壁上，原代細胞（P0）呈現(xiàn)散在細胞團生長，第1 代和第2 代的hAECs增殖速度最快，第3 代hAECs形態(tài)最為典型，顯示出鋪路石樣的上皮細胞形態(tài)，第4代胞質(zhì)逐漸鋪開，出現(xiàn)老化現(xiàn)象，見圖1a；免疫熒光染色顯示CK19 強表達，Vimentin 弱表達，見圖1b；流式細胞術檢測hAECs 表面標志物的表達，結果顯示CD29、CD44、CD73、CD90 和CD105 呈陽性，CD34 和CD45 呈陰性，見圖1c。

圖1 hAECs 形態(tài)觀察（×400），免疫熒光（×400）及流式細胞儀鑒定

2.2 關節(jié)軟骨病理切片分析 觀察各組軟骨組織的大體形態(tài)，空白對照組膝關節(jié)軟骨面光滑，無充血、裂紋等；陰性對照組關節(jié)腔內(nèi)有明顯關節(jié)積液，軟骨表面磨損部分脫落缺損；實驗組軟骨表面較為光滑，可觀察到明顯的軟骨再生。HE 染色顯示空白對照組關節(jié)滑膜細胞形態(tài)良好，未見明顯炎性細胞浸潤；陰性對照組纖維軟組織伴局部膠原化變，伴部分炎性細胞浸潤；實驗組關節(jié)腔面局部稍粗糙，纖維間質(zhì)形態(tài)較規(guī)則，炎性細胞浸潤不明顯，見圖2。

圖2 大鼠膝關節(jié)大體觀察和鏡下觀察（HE，×50）

2.3 Masson 染色和番紅固綠染色觀察 Masson 染色中，空白對照組染色正常，軟骨膠原密集且排列整齊，表層光整，形態(tài)和分布均勻；陰性對照組的軟骨藍綠色染色丟失嚴重，表層不光整；實驗組軟骨排列略顯不規(guī)則，但相較于陰性對照組軟骨染色幾乎保持完整著染，表層光整。番紅固綠染色中，空白對照組顯示軟骨排列整齊，層次清晰，潮線完整；陰性對照組軟骨細胞排列紊亂，中度失染，潮線模糊；實驗組軟骨細胞增生明顯，排列稍亂但層次可分，見圖3。

圖3 大鼠膝關節(jié)軟骨Masson 和番紅固綠染色（×20）

2.4 COL2、MMP 和TIMP 免疫組化分析 COL2、MMP 和TIMP 蛋白表達均表達于細胞質(zhì)（呈棕黃色顆粒）。陰性對照組的COL2 和TIMP 表達強度明顯弱于空白對照組，MMP 表達強于空白對照組；實驗組COL2 和TIMP表達強度明顯強于陰性對照組，MMP 表達弱于陰性對照組，見圖4。

圖4 大鼠膝關節(jié)軟骨COL2、MMP 和TIMP表達（免疫組織化學染色，×20）

2.5 各組大鼠血清及滑膜中炎癥因子含量比較 3組大鼠血清及滑膜中炎癥因子含量差異均有統(tǒng)計學差異（F≥30.561，均P ＜0.05）。陰性對照組大鼠的血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 含量均明顯高于空白對照組（均P ＜0.05），實驗組大鼠血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 含量均明顯低于陰性對照組（均P＜0.05），見表1 ～2。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子含量比較

表2 各組大鼠滑膜中炎癥因子含量比較

2.6 Western-bolt 檢測JAK2/SATA3 信號通路相關蛋白表達情況 3 組大鼠膝關節(jié)軟骨JAK2/SATA3 信號通路相關蛋白表達量差異均有統(tǒng)計學差異（F=34.176、9.273，均P ＜0.05）。陰性對照組內(nèi)蛋白表達檢測與空白對照組相比，p-JAK2 與p-STAT3 蛋白表達量均減少（均P ＜0.05）。實驗組p-JAK2 與p-STAT3 蛋白表達量均高于陰性對照組（均＜0.05），見封三彩圖1。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)軟骨JAK2/SATA3 信號通路相關的蛋白表達

3 討論

近年來，干細胞治療OA 的良好效果受到了普遍的關注，在安全性、疼痛緩解和軟骨再生方面顯示出巨大潛力。本研究將提取到的hAECs 進行形態(tài)學觀察、免疫熒光和流式細胞術鑒定，結果表明hAECs呈現(xiàn)典型的鋪路石樣形態(tài)，高表達CK19 而不表達波形蛋白。流式細胞儀檢測結果表明提取的hAECs 表達干細胞表面標記物，與之前的研究結果一致[9-10]。

目前認為，COL2 是維持正常軟骨結構、功能的重要組成部分之一[11]，而MMP和TIMPs的變化能反映出軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原的代謝變化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)移植hAECs 能明顯減輕軟骨磨損，減少炎性細胞浸潤；未接受hAECs 移植的OA 大鼠COL2 和TIMP表達和正常大鼠相比明顯減弱，MMP 表達增強，而在移植了hAECs之后，COL2 和TIMP表達明顯增多，而MMP 表達減弱。這表明hAECs 能有效調(diào)節(jié)大鼠軟骨中COL、MMP 和TIMP 的含量，保護軟骨細胞，修復受損組織，起到延緩關節(jié)軟骨退變的作用。另外，本研究結果顯示陰性對照組OA大鼠血清及滑膜中TNF- 、IL-1 、-IFN、IL-6 和IL-7 水平均高于空白對照組，移植hAECs 后可明顯抑制上述炎癥因子表達。這提示hAECs 可通過抑制OA 大鼠血液系統(tǒng)及局部滑膜部位炎性反應而改善大鼠膝關節(jié)結構及功能。

JAK2/STAT3 信號通路是調(diào)控OA 病程進展中重要的通路之一。本研究對比了各組JAK2/STAT3信號通路的相關蛋白的表達情況，結果顯示p-JAK2和p-STAT3 在陰性對照組中表達相較于健康大鼠減弱，而在移植了hAECs 進行治療后表達增強。因此，本研究認為hAECs 對于OA 的炎癥因子、膠原蛋白以及相關蛋白酶的表達是通過JAK2/P-STAT3 信號通路來調(diào)控的。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 王康：實驗設計、實驗操作、統(tǒng)計分析、論文撰寫；智曉東：實驗指導、數(shù)據(jù)整理；張玉強、張文景：細胞培養(yǎng)、實驗檢測；王偉：研究指導、論文修改、經(jīng)費支持