霍可以 羅充 高潔靜 張金霞 莫遠(yuǎn)琪 張浩 譚金玉

關(guān)鍵詞：纈草；外源激素；干旱脅迫；種子萌發(fā)；生理特性

纈草（Valeriana officinalis L．）為敗醬科（Vale-rianaceae）纈草屬（Valeriana）多年生草本植物，因其含有多種活性成分而具有安神、祛風(fēng)濕及抗抑郁等功效，可用于治療失眠、跌打損傷等病癥，其提取物及制劑已被廣泛使用。此外，纈草根莖含有揮發(fā)性纈草油成分，可作為名貴的天然食用香精。當(dāng)前，我國(guó)利用的野生纈草資源主要分布在西南及東北地區(qū)。然而，自然狀態(tài)下纈草瘦果發(fā)芽率較低，播種時(shí)間難于控制，其種子繁殖未能得到大規(guī)模推廣。此外，隨著旅游業(yè)開(kāi)發(fā)、環(huán)境破壞及過(guò)度采挖，野生資源急劇下降、日益枯竭，不能滿足生產(chǎn)需求。且已有的纈草研究主要集中在其活性成分提取、組織培養(yǎng)快繁、無(wú)菌苗和不定根繁殖等方面，鮮有種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的研究報(bào)道。

種子萌發(fā)和成苗期是植物生長(zhǎng)周期中極易受到環(huán)境因素影響的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)外界環(huán)境十分敏感。外源生長(zhǎng)物質(zhì)能夠誘導(dǎo)種子內(nèi)部貯藏物質(zhì)的分解和合成，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)種子內(nèi)各種生理變化做出反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列蛋白質(zhì)、酶的代謝，是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的重要因子之一。吲哚丁酸（IBA）作為一種生長(zhǎng)素信號(hào)分子，可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂形成新根，促進(jìn)種子胚根發(fā)育，加速種子萌發(fā)。而脫落酸（ABA）是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)過(guò)程的最重要植物激素，對(duì)種胚貯藏蛋白質(zhì)的合成起到調(diào)控作用，具有誘導(dǎo)和維持種子休眠、調(diào)控種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

當(dāng)前，由于全球氣候變暖，干旱已經(jīng)成為制約植物正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一。干旱脅迫下，外源生長(zhǎng)物質(zhì)能夠通過(guò)影響滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、增加抗氧化酶活性等方式來(lái)維持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。歐洲纈草在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段對(duì)干旱脅迫更為敏感，對(duì)其進(jìn)行干旱脅迫模擬試驗(yàn)及外源物質(zhì)緩解干旱脅迫的影響是深入分析其拮抗干旱脅迫能力的有效手段。為此，本試驗(yàn)以吲哚丁酸（IBA）、脫落酸（ABA）為供試外源生長(zhǎng)物質(zhì)，研究?jī)烧呓N對(duì)干旱脅迫下歐洲纈草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性的影響，以期為提高歐洲纈草種子的抗旱性提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年在貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。歐洲纈草（Valeriana officinalis L）種子由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。吲哚丁酸（ IBA）、脫落酸（ABA）、PEG-6000均購(gòu)于北京伊諾凱試劑公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn)

設(shè)置5個(gè)不同濃度（0、5、10、50、100、200mg/L）IBA和ABA處理。分別選取飽滿種子，經(jīng)0.5%次氯酸鈉溶液滅菌后用蒸餾水反復(fù)沖洗，再置于不同處理溶液中浸泡24h，取出后再用蒸餾水清洗數(shù)次，用濾紙吸干表面水分，放人墊有4層濾紙的發(fā)芽盒中，移至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。發(fā)芽條件：光暗比12h/12h，溫度25℃。每處理100粒種子，重復(fù)3次，蒸餾水處理作對(duì)照。

1.2.2干旱脅迫試驗(yàn)將清洗好的種子（清洗方法同1.2.1）50粒置于鋪設(shè)4層濾紙并含有不同濃度（0、10%、15%、20%和25%）PEG- 6000溶液的發(fā)芽盒中，移至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽（發(fā)芽條件同1.2.1）。參照宋瑞嬌等的方法，以胚根與種子等長(zhǎng)、胚芽達(dá)到種子長(zhǎng)1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并據(jù)此確定種子萌發(fā)的半致死干旱脅迫濃度。

1.2.3添加外源激素的干旱脅迫試驗(yàn)試驗(yàn)以蒸餾水為對(duì)照1（CKI）、半致死干旱（PEG-6000）脅迫濃度為對(duì)照2（CK2），設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)處理即半致死干旱脅迫濃度PEG-6000+最佳濃度IBA（簡(jiǎn)稱IBA處理）和半致死干旱脅迫濃度PEG-6000+最佳濃度ABA（簡(jiǎn)稱ABA處理）。各處理均選取50粒種子放到發(fā)芽盒中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（條件同1.2.1）。每處理重復(fù)3次。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1種子萌發(fā)各指標(biāo)測(cè)定方法、計(jì)算公式如下：

萌發(fā)時(shí)滯：從發(fā)芽試驗(yàn)開(kāi)始到第一粒種子萌發(fā)所需的日寸間：

發(fā)芽勢(shì)（%）=第5天正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子粒數(shù)×100;

發(fā)芽率（%）=第11天正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子數(shù)×100;

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt），式中Gt為總的發(fā)芽粒數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間（d）；

活力指數(shù)=GIxS，式中S為第11天平均根長(zhǎng)：

胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)：第11天用直尺測(cè)量，精度0.05mm;

幼苗干重：發(fā)芽第11天取幼苗放在80℃恒溫箱中烘干24h后用電子天平稱重。

1.3.2幼苗生理指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后第5、10、20天取各處理幼苗相同部位葉片進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，重復(fù)3次。參照Gao等的方法，SOD、POD、CAT活性和MDA含量采用索萊寶生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。參照Li等的方法，可溶性糖含量用蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，脯氨酸含量用酸性茚三酮顯色法測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行整理與作圖，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素（One-way ANO-VA）方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度IBA和ABA對(duì)歐洲纈草種子萌發(fā)的影響

隨著IBA濃度增加，歐洲纈草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、幼苗干重呈負(fù)相關(guān)變化趨勢(shì)（表1）。5mg/LIBA促進(jìn)效果最好，與對(duì)照相比，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別提高175.98%、204.76%、148.16%、328.02%（ P<0.05），胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、幼苗干重與對(duì)照相比分別提高108.43%、42.45%、34.72%（P<0.05），萌發(fā)時(shí)滯與對(duì)照相比縮短2天（P<0.05）。IBA濃度增加到200mg/L則顯著抑制種子萌發(fā)，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于對(duì)照。表明，低濃度IBA促進(jìn)歐洲纈草種子萌發(fā)，高濃度則對(duì)種子萌發(fā)具有顯著抑制作用。

由表2可以看出，除萌發(fā)時(shí)滯、胚芽長(zhǎng)外，隨著ABA濃度增加歐洲纈草種子的其它測(cè)定指標(biāo)均呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)ABA濃度從5mg/L增加到100mg/L時(shí)，種子萌發(fā)效率與濃度呈正相關(guān)。ABA濃度為100mg/L時(shí)效果最佳，其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、幼苗干重與對(duì)照相比分別增加90.89%、134.05%、100.59%、275.25%、164.84%、34.83% （P<0.05），其中活力指數(shù)增幅最大，幼苗干重增幅最小，說(shuō)明ABA對(duì)種子活力的影響最大：萌發(fā)時(shí)滯與對(duì)照相比縮短1.97天（P<0.05）；胚芽長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著。ABA濃度增加到200mg/L，除胚芽長(zhǎng)較100mg/L ABA處理增加外，以上其它測(cè)定指標(biāo)值均下降，說(shuō)明100mg/LABA浸種對(duì)歐洲纈草種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用。

2.2干旱脅迫對(duì)歐洲纈草種子萌發(fā)的影響

圖1顯示，歐洲纈草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均隨著PEG-6000濃度增加而下降。脅迫濃度達(dá)到10%時(shí)，種子萌發(fā)受到顯著抑制：濃度為20%時(shí)，發(fā)芽率約為對(duì)照的50%．達(dá)到半致死狀態(tài)：濃度增加到25%后，種子發(fā)芽率下降到2%，萌發(fā)進(jìn)程受到嚴(yán)重抑制。參照宋瑞嬌等的研究方法，本試驗(yàn)選取20%PEG-6000作為半致死干旱脅迫濃度，以此對(duì)歐洲纈草種子進(jìn)行干旱脅迫處理。

2.3IBA和ABA對(duì)干旱脅迫下歐洲纈草幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由圖2A可見(jiàn)，20%PEG-6000處理（CK2）歐洲纈草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與CK1（蒸餾水）相比，均下降約50%（P<0.05），外源添加5mg/LIBA和100mg/LABA其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與CK1相比，IBA處理分別提高100.5%、200.0%、157.5%（P<0.05），ABA處理分別提高99.2%、157.9%、108.3%（ P<0.05）。

由圖2B可見(jiàn)，CK2胚根長(zhǎng)與CK1相比，降低24.7%（P<0.05），而IBA和ABA處理胚根長(zhǎng)與CK1相比，分別增加35.6%、25.3%（P<0.05）。CK2單株地上部鮮重、干重和根鮮重、干重與CK1相比，分別降低28.3%、33.2%和31.5%、18.8%（P<0.05）。IBA、ABA處理與CKI相比，單株地上部鮮重分別增加17.5%（P<0.05）和8.3%（P>0.05），單株地上部干重分別增加28.4%、20.7%（P<0.05），而單株根鮮重和根干重與CKI相當(dāng)。與CK2相比，IBA和ABA處理，除根干重外，其胚根長(zhǎng)、地上部鮮重干重、根鮮重均顯著提高（P<0.05）。說(shuō)明干旱脅迫抑制歐洲纈草幼苗生長(zhǎng)，且對(duì)地上部的抑制作用更顯著，而外源添加IBA和ABA顯著提高植物的抗旱能力，IBA對(duì)植物抗旱能力的提升較ABA更強(qiáng)。

2.4IBA和ABA對(duì)干旱脅迫下歐洲纈草種子萌發(fā)過(guò)程中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是植物細(xì)胞調(diào)節(jié)滲透勢(shì)的主要物質(zhì)，其含量多少會(huì)影響植物生長(zhǎng)及其抗逆性。圖3顯示，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，歐洲纈草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量逐漸增加。與CK2（干旱脅迫）相比，同時(shí)長(zhǎng)CK1（蒸餾水）提高歐洲纈草幼苗可溶性糖含量，大多顯著提高可溶性蛋白和游離脯氨酸含量。與CK1相比，干旱脅迫下外源添加IBA和ABA，可顯著提高幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量（圖3A～C）。第20天時(shí)，與CK2相比，IBA處理此三種物質(zhì)含量分別提高28.0%、61.9%和18.4%，ABA處理分別提高15.1%、57.1%和12.8%，且可溶性蛋白和游離脯氨酸含量增幅達(dá)到顯著水平。

與CK1相比，同時(shí)長(zhǎng)CK2歐洲纈草MDA含量顯著提高，說(shuō)明干旱脅迫后膜脂過(guò)氧化程度大大提高。添加IBA和ABA后，MDA含量與CK2相比顯著降低，其中IBA和ABA處理第5天時(shí)分別較CK2降低49.9%和36.9%：隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量相對(duì)平穩(wěn)（圖3D）。

綜上所述，外源添加IBA和ABA能夠通過(guò)提高歐洲纈草種子體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量和降低MDA含量來(lái)拮抗干旱脅迫作用。

2.5干旱脅迫下IBA和ABA對(duì)歐洲纈草幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、CAT是植物細(xì)胞中與活性氧代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶，其活性與植物的抗旱性息息相關(guān)。由圖4可知，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，不同處理歐洲纈草幼苗葉片SOD、POD、CAT活性整體呈現(xiàn)不斷升高趨勢(shì)。與CKI（蒸餾水）相比，除5天時(shí)SOD活性外，其它時(shí)長(zhǎng)CK2（干旱脅迫）增加歐洲纈草幼苗SOD、POD、CAT活性。干旱脅迫下，外源添加IBA和ABA能夠顯著提高歐洲纈草幼苗SOD、POD、CAT活性。其中，第20天時(shí)，與CK1相比，IBA處理葉片SOD、POD、CAT活性分別提高116.3%、84.0%、43.7%（P<0.05），ABA處理三種酶活性分別增加104.2%、77.2%、24.6%（P<0.05）。干旱脅迫下，IBA處理比ABA提高三種抗氧化酶活性的幅度更大，表明添加IBA能更好地通過(guò)提高歐洲纈草幼苗SOD、POD、CAT活性來(lái)增強(qiáng)其抗旱性，使歐洲纈草逐漸度過(guò)干旱脅迫而恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

3討論

3.1外源IBA和ABA對(duì)歐洲纈草種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是植物開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育的第一個(gè)重要而復(fù)雜的生理階段，也是影響植物生命周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)是評(píng)價(jià)種子萌發(fā)效率的重要指標(biāo)。本研究表明，5mg/LIBA處理歐洲纈草種子萌發(fā)效果最佳，與對(duì)照相比，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別提高204.76%、175.98%和148.16%（P<0.05）。不同植物種子的IBA最佳處理濃度差異較大：屈成等研究指出，10mg/LIBA處理對(duì)水稻中嘉早17種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用最為明顯，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率明顯高于對(duì)照，而王文俊等研究顯示250%mg/LIBA處理能達(dá)到促進(jìn)催吐蘿芙木種子萌發(fā)的作用。

本試驗(yàn)中，用5～100mg/LABA處理歐洲纈草種子，其促進(jìn)萌發(fā)的作用逐漸增強(qiáng)，而濃度至200mg/L時(shí)促進(jìn)作用減弱，以100mg/LABA處理效果最好。這與趙垚等報(bào)道的適宜濃度ABA處理能提高白及種子萌發(fā)效率的結(jié)果一致，與張翔等報(bào)道的用10mg/LABA處理水稻種子對(duì)其萌發(fā)具有促進(jìn)作用、50～90mg/LABA對(duì)種子萌發(fā)具有明顯抑制作用的變化趨勢(shì)亦一致。不同外源生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)的影響不同。種子萌發(fā)和休眠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，受到諸如種子采收時(shí)期、貯藏條件、遺傳因素、萌發(fā)環(huán)境等因素影響。不同外源生長(zhǎng)物質(zhì)的處理濃度、溫度、時(shí)間都會(huì)影響到種子萌發(fā)，后續(xù)研究需要考慮處理溫度、時(shí)間等因素對(duì)其最適萌發(fā)條件進(jìn)行綜合篩選。

3.2外源IBA和ABA對(duì)干旱脅迫下歐洲纈草幼苗生理特性的影響

水分是植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，干旱對(duì)植物種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響。植物遇到干旱脅迫時(shí)，為了減少水分流失，會(huì)通過(guò)體內(nèi)積累各種有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞液濃度、降低滲透勢(shì)及維持細(xì)胞膨壓，其中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸便是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究表明，在20%PEG-6000脅迫（CK2）下，歐洲纈草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均顯著下降，萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制，且對(duì)地上部的抑制作用更顯著，這與楊利艷等的研究結(jié)果一致。外源添加5mg/L IBA和100mg/LABA，其可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量與CK2相比顯著提高，歐洲纈草的抗旱性增強(qiáng)，這與郝格格、陳娟等報(bào)道的研究結(jié)果一致。

此外，干旱脅迫下，植物體內(nèi)還會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧和自由基從而損傷細(xì)胞，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化。MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量高低能代表膜脂過(guò)氧化程度高低與抗旱性強(qiáng)弱。同時(shí)，植物細(xì)胞還會(huì)啟動(dòng)抵御活性氧傷害的抗氧化酶系統(tǒng)，通過(guò)提高保護(hù)酶（SOD、POD、CAT）活性來(lái)清除過(guò)量的活性氧和自由基，從而減少其對(duì)細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)植物抗旱性。本研究中，CK2與CK1相比，歐洲纈草MDA含量顯著上升，而外源添加5mg/LIBA和100mg/LABA后，MDA含量顯著下降，且SOD、POD、CAT活性顯著升高，與劉洋、岳凱等的研究結(jié)果一致。這進(jìn)一步說(shuō)明歐洲纈草通過(guò)提高體內(nèi)保護(hù)酶活性來(lái)使MDA含量下降，從而保護(hù)其抵御干旱脅迫。

4結(jié)論

本研究中，5mg/LIBA和100mg/LABA處理可顯著促進(jìn)歐洲纈草種子萌發(fā)，提高其發(fā)芽率。20%PEG-6000脅迫可對(duì)歐洲纈草種子萌發(fā)造成較大程度抑制，可作為歐洲纈草種子干旱脅迫的半致死濃度。外源添加5mg/LIBA和100mg/LABA可顯著改善半致死濃度干旱脅迫下歐洲纈草種子的萌發(fā)效率，提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)。適宜濃度的IBA和ABA能增加干旱脅迫下歐洲纈草葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的水勢(shì)平衡來(lái)增強(qiáng)歐洲纈草抵御干旱脅迫的能力：還可提高體內(nèi)保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性，及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)量的活性氧和自由基，降低MDA含量，進(jìn)而緩解干旱脅迫對(duì)歐洲纈草種子造成的氧化傷害。