廖夏琳?梁巍?陳嘉雯?劉坤鵬

【摘要】目的 研究強(qiáng)心苷類藥物地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒能力。方法 采用人肺泡腺癌基底上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）和非洲綠猴腎細(xì)胞（vero細(xì)胞），利用細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）確定強(qiáng)心苷類藥物地高辛和歐夾竹桃苷的細(xì)胞毒性，利用逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白免疫印跡法檢測(cè)地高辛、歐夾竹桃苷對(duì)水皰性口炎病毒（VSV）和腦心肌炎病毒（EMCV）以及仙臺(tái)病毒（SeV）和甲型流感病毒（H1N1）復(fù)制的影響。利用天然的IFN信號(hào)通路缺陷的vero細(xì)胞結(jié)合熒光顯微技術(shù)、RT-qPCR、蛋白免疫印跡法分析地高辛、歐夾竹桃苷抗病毒的作用機(jī)制是否依賴IFN信號(hào)通路。在敲低鈉鉀腺苷三磷酸（ATP）酶α1亞基（ATP1A1-shRNA）的vero細(xì)胞中，通過RT-qPCR、蛋白免疫印跡法等檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制及細(xì)胞的抗病毒IFN反應(yīng)。結(jié)果 地高辛和歐夾竹桃苷可抑制VSV、H1N1、SeV和EMCV基因表達(dá)；結(jié)合使用IFN缺陷的vero細(xì)胞證明地高辛和歐夾竹桃苷發(fā)揮抗病毒作用不依賴于IFN信號(hào)通路；在敲低ATP1A1的vero細(xì)胞中，地高辛和歐夾竹桃苷不再有明顯的抗病毒作用。結(jié)論 地高辛、歐夾竹桃苷等強(qiáng)心苷類藥物具有較廣譜的抗病毒能力，主要通過抑制細(xì)胞膜內(nèi)外鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮抗病毒作用。

【關(guān)鍵詞】地高辛；歐夾竹桃苷；抗病毒；先天免疫；鈉鉀腺苷三磷酸酶；水皰性口炎病毒；甲型流感病毒；呼吸道病毒；腦心肌炎病毒

Function of inhibition of RNA virus replication by digoxin and oleandrin Liao Xialin， Liang Wei， Chen Jiawen， Liu Kunpeng. Biotherapy Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Liu Kunpeng， E-mail： liukp5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To evaluate the antiviral ability of cardiac glycosides of digoxin and oleandrin. Methods Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cell line （A549） and African green monkey kidney cell line （vero） were used for subsequent experiment. The cytotoxicity of cardiac glycosides of digoxin and oleandrin was assessed by CCK-8 assay. The effects of digoxin and oleandrin on the replication of vesicular stomatitis virus （VSV）， encephalomyocarditis virus （EMCV）， Sendai virus （SeV） and influenza A virus （H1N1） were determined by reverse transcription-real-time quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot. Vero cells with natural interferon （IFN） signaling pathway defects combined with fluorescence microscopy， RT-qPCR and Western blot were employed to analyze whether the antiviral mechanism of digoxin and oleandrin depended on IFN signaling pathway. In vero cells with ATP1A1 （sodium potassium ATPase protein 1） （ATP1A1-shRNA） knockdown， intracellular virus replication and antiviral IFN response were detected by RT-qPCR and Western blot. Results Digoxin and oleandrin could inhibit the expression levels of VSV， H1N1， SeV and EMCV mRNA. The combination of IFN-deficient vero cells demonstrated that digoxin and oleandrin played an antiviral role independent of IFN signaling pathway. Meantime， digoxin and oleandrin exerted no antiviral effect in vero cells with ATP1A1 knockdown. Conclusion Digoxin， oleandrin and other potent cardiac glycosides have a broad spectrum of antiviral capability mainly through the inhibition of Na+/K+ ion transporters intra- and extra-cell membrane.

【Key words】Digoxin； Oleandrin； Antivirus； Innate immunity； Na+/K+-ATPase； Vesicular stomatitis virus；?Influenza A virus； Respiratory virus； Encephalomyocarditis virus

目前已知強(qiáng)心苷是一類具有加強(qiáng)心肌收縮力、減慢心率作用的苷類有機(jī)化合物，其家族部分化合物常用于心力衰竭等慢性心功能不全的治療，包括地高辛、洋地黃毒苷等［1］。強(qiáng)心苷的作用機(jī)制主要是抑制鈉離子/鉀離子（Na+/K+）通道蛋白的活性，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞膜內(nèi)外Na+/K+交換。細(xì)胞內(nèi)Na+增多可激活心肌細(xì)胞鈉離子/鈣離子（Na+/Ca2+）交換系統(tǒng)，促使細(xì)胞內(nèi)Na+外流同時(shí)促進(jìn)Ca2+轉(zhuǎn)移入細(xì)胞膜內(nèi)［2］。心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，能夠增強(qiáng)心排出量、增加回心血量，緩解心力衰竭［3］。強(qiáng)心苷類藥物在心血管系統(tǒng)的強(qiáng)心活性已廣為人知，近年有研究顯示強(qiáng)心苷類藥物可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，具有一定的抗腫瘤活性［4-5］。也有報(bào)道認(rèn)為強(qiáng)心苷類化合物有抗病毒應(yīng)用潛力［6］。在抗新型冠狀病毒（新冠病毒）的藥物篩選研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)歐夾竹桃苷等強(qiáng)心苷類藥物有較強(qiáng)的抑制新冠病毒復(fù)制能力［7-8］。已知下調(diào)細(xì)胞中鈉鉀腺苷三磷酸（ATP）酶α1亞基（ATP1A1）蛋白表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制有很強(qiáng)的抑制作用。但是強(qiáng)心苷類藥物是否具有廣譜的抗病毒能力，目前筆者尚未查及有相關(guān)的研究。本研究立足于探索強(qiáng)心苷類藥物的抗RNA病毒復(fù)制能力，使用臨床上最廣泛使用的強(qiáng)心苷類藥物地高辛和已知有一定抗病毒能力的歐夾竹桃苷處理經(jīng)RNA病毒感染的細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制情況及細(xì)胞的抗病毒IFN反應(yīng)，從而探討地高辛和歐夾竹桃苷這兩種強(qiáng)心苷藥物的廣譜抗RNA病毒活性，為強(qiáng)心苷類藥物的抗病毒研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞與病毒

所有實(shí)驗(yàn)均于本實(shí)驗(yàn)室（生物安全防護(hù)二級(jí)）中開展。人肺泡腺癌基底上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）和非洲綠猴腎細(xì)胞（vero細(xì)胞）購自美國模式菌種收集中心（ATCC），均采用富含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于

37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。ATP1A1蛋白敲低vero細(xì)胞（ATP1A1-shRNA vero）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（shRNA序列：5′-TACCGAGCTCGGATCCtctagtctccagcaacagga-3′），攜帶綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒（VSV-GFP）、水皰性口炎病毒（VSV）和腦心肌炎病毒（EMCV）以及仙臺(tái)病毒（SeV）和甲型流感病毒（H1N1）由本實(shí)驗(yàn)室保存，病毒擴(kuò)增后置于?80 ℃保存，病毒使用滴度即感染復(fù)數(shù)（MOI）值為0.1［9-10］。

二、主要試劑與儀器

地高辛、歐夾竹桃苷購自成都普思生物科技股份有限公司。Gibco DMEM高糖培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染試劑Invitrogen Lipofectamine 3000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。FBS購自美國PEAK公司；SYBR Green PCR Master Mix Kit購自Genstar公司；超敏化學(xué)發(fā)光底物（ECL）發(fā)光液購自美國Advansta公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）購自美國APExBIO有限公司；山羊抗兔IgG-HRP抗體購自美國CST公司；VSV-G抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

LC480熒光定量PCR儀為瑞士Roche公司產(chǎn)品；Proflex 96型PCR儀為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Biofuge pico 17微量離心機(jī)為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Eclipse Ti2-U型熒光倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)為上海安泰分析儀器有限公司產(chǎn)品；PowerPac型基礎(chǔ)電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；1285 Series A2 型生物安全柜為美國Thermo Scientific Forma公司產(chǎn)品。

三、方 法

1. 藥物制備

地高辛10 mg直接加入0.256 mL的二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩至澄清狀態(tài)，即為

50 mmol/L母液，分裝后儲(chǔ)存于?80 ℃?zhèn)溆谩W夾竹桃苷10 mg直接加入0.346 mL的DMSO水溶液，然后充分振蕩至液面完全澄清，即為50 mmol/L母液，分裝后儲(chǔ)存于?80 ℃處備用。

2. 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法，于96孔板中每孔細(xì)胞按照1.5×104密度接種，放置于培養(yǎng)箱中至完全貼壁；將地高辛、歐夾竹桃苷母液（50 mmol/L）用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)摩爾濃度（0、1、10、25、50 ?mol/L），按照每孔100 ?L溶液體積緩慢加入細(xì)胞中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后吸棄上清，再往每孔中加入配好的CCK-8混合溶液，孵育1.5 h，待培養(yǎng)基變至橙黃色，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（OD）值，細(xì)胞存活率（%）=［（OD實(shí)驗(yàn)組?OD空白組） /（OD對(duì)照組?OD空白組）］×100%。

3.逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）

于6孔板中，以每孔約1.2×106的密度接種A549細(xì)胞或vero細(xì)胞，至細(xì)胞完全貼壁后，再以MOI為0.01的VSV病毒、H1N1病毒、SeV病毒、EMCV病毒等分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，設(shè)對(duì)照組、病毒模型組、1 ?mol/L地高辛組、10 ?mol/L地高辛組、1 ?mol/L歐夾竹桃苷組和10 ?mol/L歐夾竹桃苷組（在檢測(cè)ATP1A1-shRNA vero細(xì)胞中VSV-GFP病毒復(fù)制的影響時(shí)，增設(shè)DMSO組），共孵育24 h后，然后在每孔中添加500 ?L的TRIzol 試劑以收集細(xì)胞，再進(jìn)行RNA提取，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR分析：采用SYBR Green PCR Master Mix Kit反應(yīng)體系，數(shù)據(jù)歸一化為18S基因，并根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算出mRNA相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增引物序列見表1。

4.蛋白免疫印跡法

于24孔板中以每孔2.4×105密度接種A549細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后以MOI為0.005的VSV病毒感染A549細(xì)胞24 h，同時(shí)加入1、10 ?mol/L的地高辛或歐夾竹桃苷共同培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和病毒模型組。共孵育24 h后收集樣品，使用BCA法進(jìn)行細(xì)胞蛋白定量，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。經(jīng)過濕法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，與稀釋好的一抗于4 ℃孵育過夜，次日取出用TBST緩沖液洗3次，再與山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，最后顯影觀測(cè)目的條帶的變化趨勢(shì)。

5.免疫熒光檢測(cè)

細(xì)胞按前述方法設(shè)組，經(jīng)藥物和病毒處理到達(dá)收樣時(shí)間后，用4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液清洗2次，置于倒置熒光顯微鏡下，使用明場(chǎng)視野拍攝細(xì)胞圖像（曝光時(shí)間15 ms，10倍鏡）。使用395 nm激發(fā)光波長激發(fā)熒光，曝光時(shí)間200 ms，10倍物鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用? 表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、地高辛和歐夾竹桃苷對(duì)A549細(xì)胞、vero細(xì)胞無毒濃度的確定

地高辛和歐夾竹桃苷在最高摩爾濃度為

50 ?mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%左右，見圖1。后續(xù)選取兩種藥物對(duì)細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性的低濃度1 ?mol/L、中濃度10 ?mol/L進(jìn)行研究。

二、地高辛和歐夾竹桃苷對(duì)A549細(xì)胞中VSV、H1N1、SeV和EMCV 病毒復(fù)制的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，病毒模型組GFP陽性細(xì)胞比例較高；與病毒模型組比較，1、10 ?mol/L的地高辛組和歐夾竹桃苷組中的GFP陽性細(xì)胞比例較低，見圖2A。RT-qPCR結(jié)果顯示，6組的VSV mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1 670.000，P < 0.001），病毒模型組VSV mRNA表達(dá)較高（P < 0.001）；地高辛組和歐夾竹桃苷組VSV mRNA相對(duì)表達(dá)量較低（P < 0.001），且10 ?mol/L 地高辛組和歐夾竹桃苷組抑制效果明顯（P < 0.001），見圖2B。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，病毒模型組抗VSV病毒G（VSV-G）蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，在分別加入了1、10 ?mol/L

地高辛和10 ?mol/L歐夾竹桃苷后，抗VSV-G蛋白表達(dá)強(qiáng)度均減弱，其中以10 ?mol/L地高辛組和

10 ?mol/L歐夾竹桃苷組抑制效果更為明顯，見圖2C。利用VSV結(jié)合H1N1、SeV、EMCV共同感染A549細(xì)胞后，6組的H1N1、SeV、EMCV mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為872.700、254.800、639.500，P均< 0.001），病毒模型組的病毒mRNA相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組升高（P < 0.001）；而加入地高辛和歐夾竹桃苷后病毒mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（P均< 0.001），見圖2D。

三、地高辛和歐夾竹桃苷對(duì)vero細(xì)胞中VSV、H1N1、SeV和EMCV病毒復(fù)制的影響?熒光成像結(jié)果表明，1 ?mol/L地高辛組和

1 ?mol/L歐夾竹桃苷組中GFP陽性的vero細(xì)胞明顯減少，見圖3A。故后續(xù)選1 ?mol/L地高辛和1 ?mol/L歐夾竹桃苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR結(jié)果顯示，4組的VSV mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1 859.000，P < 0.001），與病毒模型組比較，1 ?mol/L地高辛組和1 ?mol/L歐夾竹桃苷組的病毒mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（P均< 0.001），見圖3B。vero細(xì)胞感染H1N1、SeV和EMCV等RNA病毒時(shí)，4組的H1N1、SeV、EMCV mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為568.200、427.600、471.900，P均 < 0.001），地高辛和歐夾竹桃苷具有良好的抗病毒功能，并且這2種藥物在低濃度時(shí)（1 ?mol/L）也有較強(qiáng)的抗病毒效果，見圖3C。

四、地高辛和歐夾竹桃苷對(duì)ATP1A1-shRNA vero細(xì)胞中VSV-GFP病毒復(fù)制的影響

經(jīng)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建ATP1A1慢病毒敲低的vero細(xì)胞（ATP1A1-shRNA vero）（t = 21.600，P < 0.001），見圖4A。熒光結(jié)果顯示，與病毒模型組比較，下調(diào)ATP1A1蛋白的表達(dá)與加入地高辛和歐夾竹桃苷后的GFP陽性細(xì)胞明顯減少，見圖4B。RT-qPCR顯示，5組的VSV、EMCV、H1N1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為643.700、426.500、322.900，P均< 0.001），與病毒模型組比較，ATP1A1-shRNA vero細(xì)胞組病毒mRNA相對(duì)表達(dá)量下降（P < 0.001），地高辛和歐夾竹桃苷對(duì)于缺失ATP1A1的vero細(xì)胞抑制VSV、EMCV和H1N1病毒感染無明顯影響（P均> 0.05），見圖4C。

討論

RNA病毒具有高變異頻率的特性，較難通過靶向性藥物針對(duì)單個(gè)病毒進(jìn)行治療，近年出現(xiàn)的人畜共患起源的新冠病毒證明了這一點(diǎn)，目前仍缺乏針對(duì)冠狀病毒感染的強(qiáng)力抗病毒藥物［11］。因此，尋找廣譜的強(qiáng)效抗病毒藥物，是靶向治療RNA病毒感染性疾病的有效策略。由ATP1A1編碼Na+/K+-ATP酶的催化α亞基能夠參與多種病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程，如新冠病毒感染和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；通過基因沉默靶向ATP1A1可抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制階段，提示靶向抑制Na+/K+通道蛋白可能是一種有效的廣譜抗病毒策略［12］。

目前已有的強(qiáng)心類藥物大多靶向抑制Na+/K+通道蛋白。本研究使用強(qiáng)心苷性類藥物地高辛和歐夾竹桃苷，通過RT-qPCR、蛋白免疫印跡等技術(shù)，證明了地高辛和歐夾竹桃苷單獨(dú)處理可在細(xì)胞水平顯著抑制VSV、EMCV、H1N1和SeV病毒復(fù)制。由于vero細(xì)胞不能分泌IFN，因此受到病毒感染時(shí)可直接反映宿主細(xì)胞的抗病毒免疫狀態(tài)［13］。本研究進(jìn)一步通過在vero細(xì)胞中感染不同種RNA病毒，得出強(qiáng)心苷藥物并非作用于IFN信號(hào)通路來發(fā)揮抗病毒功能。已知敲低Na+/K+通道蛋白ATP1A1能夠顯著抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制［14-15］。本研究顯示，在ATP1A1敲低的vero細(xì)胞中，地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒作用不明顯，說明由ATP1A1可能在地高辛和歐夾竹桃苷增強(qiáng)宿主抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。本研究進(jìn)一步揭示了強(qiáng)心苷類藥物發(fā)揮抗病毒效應(yīng)的部分分子機(jī)制，為地高辛和歐夾竹桃苷的抗病毒研究提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，強(qiáng)心苷類藥物可能是一種較為有潛力的RNA病毒包括冠狀病毒感染治療方法，其通過抑制Na+/K+通道蛋白進(jìn)而發(fā)揮抗病毒活性的具體分子機(jī)制將是下一步研究的重點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-03-03）

（本文編輯：林燕薇）