張家偉，廖江龍，黃國(guó)琴，熊 飛，稅丕先

西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（瀘州 646000）

趕黃草是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜（Penthorum chinensePursh）。在四川省古藺縣有廣泛種植，被譽(yù)為“神仙草”[1]?！度珖?guó)中草藥匯編》和《四川中藥志》中記載趕黃草全草入藥具有清熱解毒、利水消腫等功效[2]，在2020 年趕黃草已經(jīng)被列入新食品原料目錄中[3]。研究表明趕黃草具有良好的解酒保肝、抗氧化、抗肝炎病毒等藥理作用[4-5]，趕黃草中槲皮素可以提高機(jī)體抗氧化水平[6]。泡騰片遇水迅速產(chǎn)生大量二氧化碳[7]，可作為一種新型的口服劑型，具有吸收快，順應(yīng)性好、體積小、方便攜帶、反應(yīng)迅速、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[8-9]，近年來(lái)泡騰片廣受關(guān)注和歡迎，并逐漸向食品和保健品領(lǐng)域拓展，果蔬汁、維生素等被添加進(jìn)其中[10-11]，作為固體飲料具有十分明顯的保健作用。

酒精性肝損傷是長(zhǎng)期飲酒或者短時(shí)間內(nèi)大量飲酒對(duì)肝臟導(dǎo)致的損害，可造成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化，更有甚者可造成肝硬化、肝癌[12-13]。我國(guó)是飲酒大國(guó)，隨著物質(zhì)條件的提高，我國(guó)每年酒精性肝病病人所占比例逐年上升[14]，但迄今為止還沒(méi)有一款對(duì)酒精性肝病有很好治療效果的藥物[15]，所以研制一款對(duì)酒精性肝病有治療和保護(hù)作用的保健產(chǎn)品具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩次酒精灌胃制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，以趕黃草泡騰片（penthorum chinensepursh effervescent tablet，PCPET）的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為趕黃草的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供了新的思路，并具有很好的應(yīng)用前景。

1 儀器與方法

1.1 材料與試劑

PCPET（實(shí)驗(yàn)室自制）：采用酸堿分別制粒壓片，響應(yīng)面優(yōu)化篩選最佳原-輔料添加量為：趕黃草浸膏粉10.0%、崩解劑34.0%（檸檬酸：碳酸氫鈉為1：1.4）、甜菊糖苷5.0%、聚乙二醇6 000 6.0%、乳糖45.0%。4%多聚甲醛（批號(hào)：70081942），Biosharp 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（ALT，批號(hào)：140121002）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（AST，批號(hào)：140221002），聯(lián)科生物；低密度脂蛋白膽固醇試劑盒（LDL-C，批號(hào)：142021005）、甘油三酯檢測(cè)試劑盒（TG，批號(hào)：141721003），mindray公司；超氧化物歧化酶試劑盒（SOD，批號(hào)：TBCYWXACDE）、還原型谷胱甘肽試劑盒（GSH，批號(hào)：PSKNK8DMNT），Elabcience 公司；56°北京二鍋頭酒（批號(hào)：20210522），北京鴻鑫酒業(yè)有限公司；甲醇（色譜純，批號(hào)：144282），賽默飛公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀（日本島津公司）；GS8024單沖式壓片機(jī)（泰州姜堰德力電機(jī)有限公司）；SY-3D 片劑四用測(cè)定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；D3024R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克SCILOGEX）；UPR-II-10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；BS360S 全自動(dòng)生化儀（邁瑞mindray 公司）；ZF-2D暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）

1.3 方法

1.3.1質(zhì)量評(píng)價(jià) 采用TLC法建立槲皮素的鑒別方法；按2020 版《中國(guó)藥典》制劑通則下對(duì)泡騰片的各項(xiàng)要求對(duì)PCPET 的片重、重量差異、硬度、脆碎度、產(chǎn)氣量、崩解時(shí)限、pH 值等指標(biāo)進(jìn)行檢查；采用HPLC 法建立PCPET槲皮素的含量測(cè)定。

1.3.2小鼠的分組、造模和給藥 將60只SPF級(jí)昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物組（聯(lián)苯雙酯滴丸溶液0.15 g·kg-1）、趕黃草泡騰片高、中、低劑量組（8、4、2 g·kg-1），每組10 只，雌雄各半，參照文獻(xiàn)[16]的方法，分別在給藥后的第7 d和第21 d灌胃56°紅星二鍋頭，劑量分別為0.01 L/kg、0.016 L/kg，空白組灌胃等量生理鹽水，以小鼠肝臟系數(shù)、血清ALT、AST 值來(lái)判斷小鼠肝損傷模型是否成功。按照體重0.1 mL/10 g每天灌胃相應(yīng)藥物一次，連續(xù)灌胃21 d，空白組和模型組灌胃生理鹽水。本研究通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批同意（審批號(hào)：20211206-003）。

1.3.3小鼠生化指標(biāo)的檢測(cè) 小鼠第21 d 酒精灌胃后禁食不禁水12 h。眼球取血，靜置2 h，3 500 r/min離心15 min，得到血清，將小鼠頸部脫臼處死、取出肝臟、生理鹽水沖洗干凈并除去多余水分，稱(chēng)重并計(jì)算肝臟系數(shù)，將部分肝-80 ℃低溫凍存?zhèn)溆?，剩余部分?%多聚甲醛溶液固定備用。

取小鼠血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ALT、AST 和LDL-C 的水平。取凍存的肝組織，制成10%的肝組織勻漿，3 500 r/min低溫離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)勻漿中SOD、GSH和TG的水平。

1.3.4肝臟組織病理學(xué)觀察 取出固定的肝組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度約為4 μm）再經(jīng)HE染色后，置于生物顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織病變情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1PCPET 片重、重量差異、硬度、脆碎度、產(chǎn)氣量、崩解時(shí)限、pH 值測(cè)定 PCPET 表面光滑、顏色均勻、無(wú)松片裂片現(xiàn)象，表面呈淺黃綠色，口味佳，PCPET 中不完整、表面粗糙、色澤不均勻、畸形、有較大花斑或嚴(yán)重異物的片劑較少。隨機(jī)取20片所制的PCPET片，總重量9.56 g，平均片重0.48 g、平均重量差異為2%，重量差異符合藥典要求。隨機(jī)取5片PCPET測(cè)得平均產(chǎn)氣量6.5 mL，泡沫細(xì)密消散較快，符合藥典對(duì)泡騰片產(chǎn)氣量的要求。隨機(jī)取3 片PCPET 測(cè)得平均硬度33.60 N，硬度適中、脆碎度1.0%、平均崩解時(shí)限3'43″均小于5 min、pH 值4.82～5.15 之間呈弱酸性，各檢查指標(biāo)均滿(mǎn)足《中國(guó)藥典》中泡騰片的制劑通則要求。

2.1.2PCPET 薄層色譜鑒別 精密稱(chēng)定槲皮素對(duì)照品20 mg于10 mL容量瓶中加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液；取200 mg 趕黃草浸膏粉和1 g泡騰片粉末分別加入50 mL甲醇溶解、過(guò)濾，向?yàn)V液中加入5 mL 24%HCl溶液，70 ℃水浴加熱1.5 h，立即冷卻后蒸干，殘?jiān)蛹状既芙馐钩?0 mL，搖勻，即得趕黃草浸膏供試品溶液和PCPET 供試品溶液；取10 mL 甲醇溶液，作為陰性對(duì)照品溶液。以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（5∶4∶1）預(yù)飽和10 min，展開(kāi)，取出，晾干、噴以1 %AlCl3-乙醇溶液，揮干溶劑，置于紫外光燈365 nm下檢視，在供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置顯同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 3批次PCPET槲皮素薄層色譜圖Figure 1 TLC of quercetin in 3 batches of PCPET

2.1.3PCPET槲皮素含量測(cè)定 精密稱(chēng)定5 mg槲皮素對(duì)照品、1g PCPET粉末并按照2.5.2項(xiàng)的方法配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，以Agilent 5 HC-C18（2）色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.5 %磷酸水（50∶50），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 槲皮素HPLC圖Figure 2 HPLC chromatogram of quercetin

圖3 PCPET的HPLC圖Figure 3 HPLC chromatograms of PCPET

精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得出線(xiàn)性回歸方程：y=4E+06x-32130 R2=1，表明在1 μg～6 μg質(zhì)量范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Figure 4 Standard graph

經(jīng)過(guò)測(cè)定儀器的精密度良好，槲皮素24 h 穩(wěn)定性良好，方法重現(xiàn)性良好，方法可行。平均加樣回收率100.44%，結(jié)果見(jiàn)表1。取1 g 泡騰片粉末，精密稱(chēng)定，根據(jù)2.1.2項(xiàng)的方法平行配制3個(gè)批次PCPET供試品溶液，精密吸取供試品20 μL進(jìn)樣，計(jì)算峰面積。計(jì)算得出制備的PCPET 槲皮素平均含量約為0.76 mg/g，見(jiàn)表2。

表1 方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Methodological test results

表2 槲皮素含量（）Table 2 Quercetin content

表2 槲皮素含量（）Table 2 Quercetin content

2.2 PCPET對(duì)小鼠體重、肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響

兩次酒精灌胃以后小鼠均出現(xiàn)了四肢無(wú)力、站立不穩(wěn)、腹部抽搐、呼吸急促等不同程度的醉酒狀態(tài)且毛色不光亮、飲食、飲水減少等情況，次日體重均有所下降。結(jié)果顯示模型組平均體重低于空白組，平均肝質(zhì)量增加，與空白組相比肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01），陽(yáng)性藥物組與模型組相比肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PCPET各劑量組的肝臟指數(shù)均低于陽(yáng)性藥物組，PCPET 各劑量組與模型組肝臟指數(shù)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示PCPET 具有降低急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)作用，見(jiàn)表3。

表3 PCPET對(duì)小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of PCPET on liver weight and liver index in mice（，n=10）

表3 PCPET對(duì)小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effects of PCPET on liver weight and liver index in mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.3 PCPET 對(duì)小鼠血清中ALT、AST、LDL-C 的影響

與空白組對(duì)比，模型組ALT、AST、LDL-C水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明模型制備成功。各給藥組與模型組相比ALT 值降低（P＜0.05）；陽(yáng)性藥物組、PCPET 中、高劑量組均可降低AST 值（P＜0.05）。各給藥組LDL-C 與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示，PCPET可以通過(guò)抑制ALT、AST活性，緩解肝臟受損時(shí)脂質(zhì)代謝紊亂的作用從而起到保護(hù)肝臟的作用，見(jiàn)表4。

表4 PCPET對(duì)小鼠血清中ALT、AST、LDL-C的影響（，n=10）Table 4 Effects of PCPET on ALT，AST，LDL-C in the sera of mice（，n=10）

表4 PCPET對(duì)小鼠血清中ALT、AST、LDL-C的影響（，n=10）Table 4 Effects of PCPET on ALT，AST，LDL-C in the sera of mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.4 PCPET對(duì)小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響

模型組與空白組相比，酒精急性灌胃導(dǎo)致GSH 活性顯著降低（P＜0.01），TG 含量顯著升高（P＜0.01）。PCPET 低、中劑量組和陽(yáng)性藥物組與模型組相比可以升高受損肝細(xì)胞的SOD 活性水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且不存在劑量依存關(guān)系，PCPET低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組與模型組相比可增加GSH的活性水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），PCPET中、高劑量組與模型組相比可降低TG水平（P＜0.05）。結(jié)果表明PCPET 可以通過(guò)提高SOD 和GSH 的活性作用來(lái)保護(hù)肝臟，與文獻(xiàn)[17]結(jié)果一致，同時(shí)可以降低組織中TG 含量，加速脂質(zhì)代謝，防止肝臟往脂肪肝、肝硬化、肝纖維化等惡性肝病發(fā)展，見(jiàn)表5。

表5 PCPET對(duì)小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響（，n=10）Table 5 Effects of PCPET on SOD，GSH and TG in the liver homogenates of mice（，n=10）

表5 PCPET對(duì)小鼠肝勻漿中SOD、GSH和TG的影響（，n=10）Table 5 Effects of PCPET on SOD，GSH and TG in the liver homogenates of mice（，n=10）

注：與空白組比，aP ＜0.01；與模型組比，bP ＜0.05，cP ＜0.01。

2.5 PCPET對(duì)肝損傷小鼠病理形態(tài)的影響

小鼠肝臟HE 染色后可見(jiàn)空白組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊清晰；模型組小鼠肝細(xì)胞病變嚴(yán)重，腫脹變形，具有明顯的彌漫性空泡變形，有輕微的炎性浸潤(rùn)，陽(yáng)性藥物組結(jié)構(gòu)較為正常，肝細(xì)胞空泡變性；PCPET 低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)較正常，未見(jiàn)明顯肝組織結(jié)構(gòu)改變；PCPET 中劑量組見(jiàn)散在少量肝細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)；PCPET 高劑量組見(jiàn)散在肝細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)且有肝細(xì)胞空泡變性。綜上，PCPET 可以減輕模型組肝細(xì)胞的空泡變性，維持肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，減肝細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)從而起到保護(hù)肝臟的作用，見(jiàn)圖5。

圖5 小鼠肝組織HE染色切片（200×）Figure 5 HE-stained sections of mouse liver tissue（200×）

3 討論

酒精性肝病是危害我國(guó)人民健康的主要肝臟疾病[18]，已經(jīng)成為繼甲肝、乙肝后最大的肝類(lèi)疾病，且逐漸年輕化，酒精性肝損傷病人占肝病病人的比例逐年升高[19]。肝臟是人體代謝酒精重要的器官，酒精代謝產(chǎn)生大量的乙醛，對(duì)肝臟有毒性作用，影響線(xiàn)粒體ATP生成，導(dǎo)致細(xì)胞脂肪和蛋白質(zhì)分泌受阻，進(jìn)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝臟疾病[20-21]，酒精是極具滲透性的小分子有機(jī)物，當(dāng)人體大量攝入酒精以后，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，造成肝臟的直接損傷。酒精性肝病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到多因素共同作用[22]，以往研究顯示，趕黃草可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制肝臟炎癥反應(yīng)起到保護(hù)肝臟的作用[23]。

2020版《中國(guó)藥典》中規(guī)定泡騰片的崩解時(shí)間要小于5 min，但是中藥浸膏泡騰片常存在崩解超限的情況，導(dǎo)致質(zhì)量不合格，本研究在PCPET的制備初期同樣出現(xiàn)過(guò)這個(gè)問(wèn)題。除了與崩解劑的種類(lèi)、用量、加入方式有關(guān)外，也與浸膏粘度相關(guān)，粘度大影響水分進(jìn)入片劑內(nèi)與崩解劑發(fā)生反應(yīng)。在質(zhì)量評(píng)價(jià)中，2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定要求崩解溫度在25 ℃左右，測(cè)定發(fā)泡量的液體溫度在37 ℃左右，接近體溫，推測(cè)是以泡騰片體內(nèi)反應(yīng)溫度作為考評(píng)，如陰道泡騰片。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的崩解時(shí)間以及產(chǎn)氣量只是剛好滿(mǎn)足藥典的要求，質(zhì)量不佳。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為藥典規(guī)定的測(cè)量溫度不適用于PCPET 的評(píng)價(jià)體系，作為一種固體飲品，可用溫水服用，且對(duì)槲皮素等營(yíng)養(yǎng)成分不會(huì)產(chǎn)生破壞作用，所以建議適當(dāng)提高測(cè)定溫度的范圍，這樣既符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，又符合實(shí)際服用情況。

PCPET 雖然是實(shí)驗(yàn)室自制的功能性飲品保健品，但通過(guò)制備工藝的優(yōu)化、質(zhì)量初步評(píng)價(jià)，實(shí)現(xiàn)了工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定、療效優(yōu)良的效果，為未來(lái)投入生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠兩次酒精灌胃沖擊成功制備了急性酒精性肝損傷模型，測(cè)定了ALT、AST、LDL-C、SOD、GSH 和TG 的水平，肝臟病理組織切片結(jié)果顯示PCPET 對(duì)ALT、AST 的酶活性有降低作用，可以提高抗氧化水平及脂質(zhì)代謝，表明PCPET 對(duì)急性酒精性肝損傷具有很好的保護(hù)作用。研究表明槲皮素是趕黃草保肝的主要活性成分，采用TLC對(duì)PCPET中槲皮素鑒別，應(yīng)用HPLC法對(duì)槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的PCPET進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)可以建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，PCPET 對(duì)急性酒精性肝損傷有很好的保護(hù)作用且質(zhì)量穩(wěn)定，為趕黃草的深度開(kāi)發(fā)提供了方向，為酒精性肝損傷防治相關(guān)的功能性食品、保健品開(kāi)發(fā)也提供了有效研究基礎(chǔ)。