侯穎瑩，趙慣軍，賈耀麗，王 艷

1.平頂山市第一人民醫(yī)院 普兒一科（平頂山467000）；2.平頂山市第一人民醫(yī)院 新生兒重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)（平頂山467000）；3.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科（鄭州 450000）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的呼吸道疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國(guó)哮喘的患病率為0.5%～5.8%[2]。近年來(lái)，哮喘的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，兒童哮喘在過(guò)去十年的發(fā)病率上升了64.52%。哮喘具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點(diǎn)，不僅影響兒童身體健康和日?；顒?dòng)，還會(huì)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和心理造成不利影響[3]。

哮喘是一種受遺傳、環(huán)境因素雙重影響的多基因復(fù)雜性疾病[4]。變應(yīng)原、運(yùn)動(dòng)等環(huán)境因素是哮喘發(fā)病的重要誘因，遺傳因素則可影響個(gè)體對(duì)哮喘的易感性[5]。THOMSEN[6]等的雙生子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘的遺傳度達(dá)到36%～78%。哮喘作為多基因遺傳性疾病，單個(gè)基因?qū)ο谋硇陀绊懹邢蓿鄠€(gè)基因的累積效應(yīng)構(gòu)成了哮喘的遺傳性。尋找哮喘的易感基因并分析基因間的相互作用對(duì)兒童哮喘的預(yù)防、診斷和治療具有重要作用。白介素-22（interleukin-22，IL-22）是主要由T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子。有研究指出，IL-22在誘導(dǎo)呼吸道炎癥和形成氣道高反應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用[7]。RAD50基因可編碼DNA 修復(fù)蛋白，還能調(diào)控白介素-13 等相鄰基因的表達(dá)[8]。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAD50基因突變對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥有明顯的緩解作用，白介素-4、白介素-13、白介素-25 等炎癥因子在RAD50基因突變小鼠的表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯的下降，提示RAD50基因可能與哮喘的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]。本研究選取IL-22、RAD50基因的4個(gè)位點(diǎn)，探討二者基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年1月在河南省平頂山市第一人民醫(yī)院收治的哮喘患兒76例作為觀察組，年齡8個(gè)月～14歲，平均年齡（6.51±2.13）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②獲得患兒及家屬知情同意；③本研究符合《赫爾辛基宣言》。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫障礙、惡性腫瘤等。另選取同期體檢健康的兒童62例作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①體檢健康；②依據(jù)觀察組患兒性別和年齡進(jìn)行匹配。

1.2 方法

1.2.1背景資料收集 收集兩組年齡、性別、出生方式、出生時(shí)體重、喂養(yǎng)方式、1歲內(nèi)抗生素使用次數(shù)、寵物飼養(yǎng)情況、家族過(guò)敏史、家族哮喘史、被動(dòng)吸煙等情況。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 取兩組受試對(duì)象靜脈血3 mL，采用天根公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA。使用美國(guó)GE 公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度及純度。經(jīng)Hapmap 檢索IL-22、RAD50基因組序列SNP 位點(diǎn)，選取IL-22基因的rs17224704 位點(diǎn)、rs2227473 位 點(diǎn)，RAD50基 因 的rs6871536 位 點(diǎn)、rs17166050 位點(diǎn)。使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物序列。引物由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系如下：上下游引物各1 μL，2×Taqman 通用預(yù)混物5 μL，全基因組模板1 μL，ddH2O 2 μL，共計(jì)10 μL。反應(yīng)設(shè)置條件：95 ℃8 min，42 個(gè)循環(huán)，95 ℃10 s，65 ℃25 s，72 ℃10 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后選取對(duì)應(yīng)條帶送交上海生工生物公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，等位基因頻率和位點(diǎn)基因型采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，符合正態(tài)分析計(jì)量資料采用表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，影響兒童哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析采用Logistic 回歸分析。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

兩組出生方式、1歲內(nèi)抗生素使用次數(shù)、飼養(yǎng)寵物、家族過(guò)敏史、家族哮喘史、被動(dòng)吸煙等情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），年齡、性別、出生時(shí)體重、喂養(yǎng)方式比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較[n（%）]Table 1 Comparison of baseline data between the two groups[n（%）]

2.2 兩組IL-22基因型及等位基因頻率分布

兩組IL-22基因rs17224704 位點(diǎn)、rs2227473 位點(diǎn)基因型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)表2；兩組IL-22基因rs17224704 位點(diǎn)、rs2227473 位點(diǎn)等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 兩組IL-22基因型分析Table 2 IL-22 genotype analysis of the two groups

表3 兩組IL-22基因等位基因頻率分布Table 3 Allele frequency distribution of IL-22 gene in the two groups

2.3 兩組RAD50基因型及等位基因頻率分布

兩組RAD50基因rs6871536 位點(diǎn)、rs17166050 位點(diǎn)基因型、等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4、表5。

表4 兩組RAD50基因型分析Table 4 RAD50 genotypes in the two groups

表5 兩組RAD50基因等位基因頻率分布Table 5 Allele frequency distribution of RAD50 gene in the two groups

2.4 基因-基因交互作用與兒童哮喘易感性分析

將分組引入因變量，位點(diǎn)基因型及其交互項(xiàng)引入Logistic回歸模型自變量，其他因素作為控制變量，分析IL-22基因與RAD50基因之間的交互作用，結(jié)果顯示，在相乘模型中rs17224704 位點(diǎn)、rs2227473 位點(diǎn)存在交互作用，交互項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余交互項(xiàng)未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)表6。

表6 基因-基因交互作用與兒童哮喘易感性分析Table 6 Analysis of gene-gene interaction and susceptibility to asthma in children

2.5 影響兒童發(fā)生哮喘的多因素回歸分析

以兒童是否發(fā)生哮喘賦值（發(fā)生=1，未發(fā)生=0），納入出生方式、1歲內(nèi)抗生素使用次數(shù)、飼養(yǎng)寵物、家族過(guò)敏史、家族哮喘史、被動(dòng)吸煙、IL-22基因rs17224704位點(diǎn)等位基因頻率（A=0，T=1）、IL-22基因rs2227473位點(diǎn)等位基因頻率（A=0，G=1）、RAD50基因rs6871536 位點(diǎn)基因型（CC=0，CT=1，TT=2）、rs6871536位點(diǎn)等位基因頻率（C=0，T=1）、rs17166050 位點(diǎn)基因型（AA=0，AG=1，GG=2）、rs17166050 位點(diǎn)等位基因頻率（A=0，G=1）等指標(biāo)進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，有家族過(guò)敏史、家族哮喘史兒童發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加（P＜0.05），IL-22基因rs17224704 位點(diǎn)攜帶等位基因A 的兒童發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)較攜帶T的兒童增加（P＜0.05），RAD50基因rs6871536位點(diǎn)攜帶等位基因C 的兒童發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)較攜帶T 的兒童增加（P＜0.05），見(jiàn)表7。

表7 影響兒童哮喘發(fā)生的Logistic回歸分析Table 7 Logistic regression analysis of asthma in children

3 討論

哮喘易感基因的篩選和確定，不僅是哮喘發(fā)生高危人群診斷和制定干預(yù)決策的科學(xué)依據(jù)，也是哮喘發(fā)病機(jī)制研究、靶向基因及藥物治療的基礎(chǔ)[11]。隨著哮喘易感基因研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)大量易感基因與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。BRANDT[12]等在排除了對(duì)照組中既往有哮喘家族史和過(guò)敏癥狀的兒童，實(shí)行更佳嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，表面活性蛋白D 基因的rs721917 位點(diǎn)的C/C 基因攜帶兒童罹患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)降低。鐘丹丹[13]等的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者血清IL-18水平降低，攜帶（-607C/A）AA 基因型的人群罹患哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加。STAT3基因內(nèi)含子11rs2293152C/G 的多態(tài)性與川南地區(qū)兒童哮喘的易感性相關(guān)，可作為兒童哮喘潛在預(yù)測(cè)性標(biāo)志物之一[14]。

IL-22基因于2000年經(jīng)Dumoutier在研究T淋巴細(xì)胞時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。IL-22基因長(zhǎng)約6 kb，定位于染色體12q15 上。IL-22基因編碼的蛋白經(jīng)剪切、修飾作用后可與其受體結(jié)合，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[15]。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠對(duì)比，哮喘模型小鼠外周血IL-22 水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步對(duì)肺組織分析發(fā)現(xiàn)，哮喘組IL-22mRNA水平、IL-22蛋白表達(dá)水平也明顯高于正常對(duì)照組[16]。張國(guó)偉[17]等的研究指出，哮喘患者治療前外周血IL-22呈現(xiàn)較高水平，經(jīng)霧化吸入治療后患者臨床癥狀明顯緩解，血清IL-22 顯著降低。TAUBE[18]等的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，IL-22基因剔除的哮喘小鼠模型較正常哮喘小鼠模型肺部炎性反應(yīng)明顯減輕，炎性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞數(shù)目顯著降低，支氣管管腔狹窄和平滑肌細(xì)胞增生等氣道重塑現(xiàn)象明顯減輕。以上研究表明，IL-22的表達(dá)與哮喘的炎癥狀態(tài)及氣道重構(gòu)有關(guān)，其在哮喘的疾病發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。有研究顯示，IL-22基因多態(tài)性與腫瘤、炎癥反應(yīng)性疾病的易感性有關(guān)。但I(xiàn)L-22基因多態(tài)性與兒童哮喘的易感性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取rs17224704、rs2227473 兩個(gè)與炎癥相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)，經(jīng)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒rs17224704位點(diǎn)等位基因A攜帶頻率顯著高于正常對(duì)照組；進(jìn)一步行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，rs17224704位點(diǎn)攜帶等位基因T 的兒童罹患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)降低，結(jié)合上述數(shù)據(jù)推測(cè)，IL-22基因rs17224704位點(diǎn)多態(tài)性可能對(duì)其表達(dá)水平有一定影響，rs17224704 位點(diǎn)攜帶等位基因A 的兒童IL-22基因轉(zhuǎn)錄水平或活性較攜帶等位基因T 的兒童更高，接觸過(guò)敏原等環(huán)境刺激后氣道炎癥反應(yīng)更為強(qiáng)烈，因而具有更高的易感性。RAD50基因位于染色體5q31.1 區(qū)域，其編碼的大分子蛋白是DNA雙鏈斷裂的主要感受器，并參與DNA修整恢復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列環(huán)節(jié)。此外，RAD50基因靠近白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-13 等炎癥因子的編碼區(qū)域，上述炎癥因子的可刺激B 淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白E（IgE），與嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞結(jié)合后可引起組胺的釋放，從而引發(fā)哮喘[19]。目前RAD50通過(guò)引起Th2t 細(xì)胞對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而誘發(fā)哮喘的途徑已經(jīng)得到證實(shí)[20]。一項(xiàng)納入1 707 例兒童的研究顯示，在排除人口學(xué)差異、環(huán)境暴露等多方面的干擾因素后發(fā)現(xiàn)，RAD50基因多態(tài)性對(duì)兒童哮喘的發(fā)生具有顯著預(yù)測(cè)價(jià)值（AUC=0.70）[21]。MURK[22]等的研究顯示，RAD50基因rs2750347 位點(diǎn)的基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有關(guān)聯(lián)性。于美麗[23]等利用質(zhì)譜SNP技術(shù)對(duì)160例兒童的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒RAD50基因rs6871536 位點(diǎn)基因型與等位基因頻率與正常兒童存在顯著差異，與本研究結(jié)果相近。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，RAD50基因rs6871536位點(diǎn)等位基因C 頻率增加是兒童罹患哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，綜合上述因素推測(cè)原因如下：①執(zhí)行錯(cuò)配修復(fù)功能時(shí)增加哮喘相關(guān)易感基因突變頻率，激發(fā)轉(zhuǎn)錄活性；②調(diào)控臨近炎癥因子的轉(zhuǎn)錄效率和轉(zhuǎn)錄活性，從而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)性，形成過(guò)敏性體質(zhì)，增加哮喘易感性。目前認(rèn)為單一基因?qū)ο赘行缘挠绊懶Ч邢蓿嗷蛑g的交互作用在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。本研究對(duì)選取的4 個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，rs17224704 位點(diǎn)與rs2227473 位點(diǎn)存在交互作用，說(shuō)明多基因的相互作用、相互積累發(fā)揮的功能可能高于單個(gè)基因的效用。

本研究結(jié)果顯示，具有家族過(guò)敏史和家族哮喘史是兒童哮喘發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。具有家族過(guò)敏史的兒童一般伴隨著機(jī)體對(duì)塵螨、花粉等特定物質(zhì)產(chǎn)生高反應(yīng)性。這種高反應(yīng)性針對(duì)不同的部位表現(xiàn)形式各異，如過(guò)敏性結(jié)膜炎、過(guò)敏性鼻炎、蕁麻疹等。過(guò)敏體質(zhì)兒童受到外界變應(yīng)原刺激時(shí)機(jī)體IgE數(shù)量異常升高，哮喘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)大大增加[24]。哮喘在臨床表現(xiàn)的家族聚集性很早就受到關(guān)注。近年來(lái)隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，哮喘的多基因遺傳性得到普遍證實(shí)。有研究指出，父母均患哮喘的兒童哮喘發(fā)生率為42.1%～60.5%，直系血親無(wú)哮喘病史的兒童發(fā)病率只有6%～9%左右[25]。胡倩[26]等的研究發(fā)現(xiàn)，直系親屬患有哮喘是哮喘患病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，證實(shí)家族遺傳對(duì)兒童罹患哮喘具有重要影響，因此具有哮喘家族史的兒童應(yīng)日常提高防護(hù)能力。具有家族過(guò)敏史和哮喘史的兒童應(yīng)避免接觸過(guò)敏原，做好日常防護(hù)和監(jiān)測(cè)，防止哮喘的發(fā)生。本研究樣本量較小，結(jié)果還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并深入研究。

4 結(jié)論

IL-22基因rs17224704位點(diǎn)、RAD50基因rs6871536位點(diǎn)基因多態(tài)性均與兒童哮喘易感性密切相關(guān)，IL-22基因rs17224704位點(diǎn)攜帶等位基因A的兒童發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)較攜帶T 的兒童增加，RAD50基因rs6871536 位點(diǎn)攜帶等位基因C的兒童發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加。