劉欣雨 ,鐘文彩 ,肖 靜 ,唐冬梅 ,葉 脈 ,鄭有坤

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥物與功能性食品研究中心（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（瀘州 646000）

皮膚黑色素瘤是一種起源于皮膚黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，占皮膚癌患者死亡人數(shù)的80%以上[1]。手術(shù)治療是目前治療皮膚黑色素瘤最主要的方法，但手術(shù)治療易遺留瘢痕，且黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散也使得術(shù)后預(yù)后較差，極易引起腫瘤復(fù)發(fā)和傷口感染[2]。此外，藥物化療對患者身體毒副作用較大，對患者的生存獲益相對有限[3]。因此，急需尋找更加理想的治療策略用于臨床皮膚黑色素瘤治療。

光熱療法（photothermal therapy,PTT）和光動(dòng)力療法（photodynamic therapy,PDT）是應(yīng)用于癌癥治療的兩種主要光療法，可在光敏劑存在的條件下通過激光照射產(chǎn)生光熱效應(yīng)和誘導(dǎo)生成具有細(xì)胞毒性的活性氧物種，如單線態(tài)氧（1O2），進(jìn)而殺死癌細(xì)胞[4-6]。目前將PTT 和PDT 聯(lián)用主要通過將光熱轉(zhuǎn)化劑和光敏劑共載，聯(lián)合PTT/PDT 以增強(qiáng)抗腫瘤療效[7]。然而，現(xiàn)有的PTT/PDT 聯(lián)合多為物理性結(jié)合，大多將彼此相對獨(dú)立的光熱試劑和光敏劑整合，組裝體系穩(wěn)定性差，治療時(shí)常需采用兩種不同波長光源，難以實(shí)現(xiàn)在單一光源激發(fā)下同時(shí)發(fā)揮光熱和光動(dòng)力效應(yīng)[8]，因此其臨床推廣和治療效果均相對有限。

納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展為單一光源下實(shí)現(xiàn)PTT/PDT聯(lián)合治療提供了新的方向。金納米團(tuán)簇（AuNCs）是一類尺寸小于2 nm的納米聚集體，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和卓越的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[9-11]。甲巰丙脯酸（captopril）是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，具有抑制血管生成、改善腫瘤轉(zhuǎn)移的藥效[12-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該小分子抑制劑功能化的AuNCs 可在近紅外激光下同時(shí)激發(fā)光熱效應(yīng)和誘導(dǎo)1O2生成。因此，本研究在對該P(yáng)TT/PDT納米體系性能表征的基礎(chǔ)上，以小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10 為對象，研究其體外抗黑色素瘤的潛力和生物安全性，為皮膚黑色素瘤治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

甲巰丙脯酸、HAuCl4、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NaBH4和NaOH購買于阿拉丁試劑；小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10 購買于中科院上海細(xì)胞生物所；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞活性檢測試劑盒購買于碧云天生物；單線態(tài)氧檢測試劑（Singlet Oxygen Sensor Green,SOSG）購買于ThermoFisher；超濾離心管（3 kD）購買于Millipore。

1.2 AuNCs的合成與表征

AuNCs 的合成采用Xie 等[14]建立的NaOH 介導(dǎo)NaBH4還原法進(jìn)行。在磁力攪拌下，將0.25 mL 20 mM的HAuCl4與2 mL 5 mM 的甲巰丙脯酸混合溶于2.35 mL水中，形成甲巰丙脯酸-Au（I）復(fù)合物。隨后，將0.3 mL 1 M 的NaOH 加入上述反應(yīng)體系，并將0.1 mL 溶于0.2 M NaOH 的NaBH4（112 mM）再快速加入該反應(yīng)體系，繼續(xù)反應(yīng)3 h。待反應(yīng)結(jié)束后，采用超濾離心對AuNCs進(jìn)行純化。

AuNCs 的形貌和分散性采用JEM-2100 TEM 進(jìn)行表征，粒徑統(tǒng)計(jì)采用Nano Measurer 進(jìn)行；使用756S 型紫外可見分光光度計(jì)記錄AuNCs 的光譜特征；AuNCs的zeta 電位采用Malvern Nano ZS Zetasizer 90 測定；采用ULVAC-PHI5000 Versaprobe XPS 表征AuNCs 中金屬的價(jià)態(tài)。

1.3 AuNCs的光熱效應(yīng)測定

采用2 W/cm2808 nm 激光照射不同濃度的AuNCs 10 min，每隔1 min采用FLIR C5熱成像儀拍照，記錄溶液溫度變化。為評估AuNCs 的光熱穩(wěn)定性，待激光照射AuNCs 10 min后即移除激光，自然降溫10 min，記錄溫度變化過程，以上過程重復(fù)3 次循環(huán)。光熱轉(zhuǎn)化效率（η）根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法計(jì)算。

1.4 AuNCs的光動(dòng)力效應(yīng)測定

采用SOSG 檢查808 nm 激光照射不同時(shí)間時(shí)體系中的1O2生成情況，以評估AuNCs 的光動(dòng)力效應(yīng)。1O2生成的相對濃度以488 nm 激發(fā)波長條件下530 nm 波長的熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 AuNCs對B16F10的細(xì)胞毒性研究

為評估AuNCs 的生物安全性，采用CCK-8 法評估了不同濃度處理對B16F10 的細(xì)胞毒性。AuNCs 的終濃度分別設(shè)定為0、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。細(xì)胞存活率（%）以實(shí)驗(yàn)組與空白對照組觀測值的比值表示。以細(xì)胞存活率大于85%為安全濃度，測定對B16F10細(xì)胞安全的AuNCs濃度。

1.6 近紅外激光激發(fā)下AuNCs對B16F10的殺滅效應(yīng)

將B16F10 種植于96 孔板中，設(shè)置空白對照組、AuNCs治療組、激光照射組、AuNCs+激光照射組，每組5 個(gè)重復(fù)，AuNCs 組和AuNCs+激光照射組各孔內(nèi)添加最大安全濃度的AuNCs，避光培養(yǎng)2 h。激光組和AuNCs+激光照射組各孔細(xì)胞均采用2 W/cm2808 nm激光照射10 min。同時(shí)，采用熱成像儀和SOSG法分別檢測細(xì)胞溫度變化及1O2生成情況。37°C 培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法檢測各組細(xì)胞存活率。此外，為區(qū)分PTT 和PDT 對抗癌活性的貢獻(xiàn)，在上述實(shí)驗(yàn)分組的基礎(chǔ)上添加AuNCs+激光照射+NAC 組、AuNCs+激光照射+冰浴組以分別去除1O2和熱效應(yīng)的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)間的差異性比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AuNCs的表征

通過NaOH介導(dǎo)NaBH4還原，甲巰丙脯酸功能化的AuNCs被成功合成。如圖1A所示，合成的AuNCs溶液呈棕色，在440、552、670、760 nm 處均具有一定的紫外吸收峰，這與Au25（SR）18（SR=配體）的特征吸收峰一致[14,16-17]，表明該AuNCs 可能具有Au25的結(jié)構(gòu)特征。高分辨TEM 顯示，AuNCs 呈顆粒狀團(tuán)簇，平均粒徑（1.6±0.2）nm，分散均勻（圖1B、1C）。XPS 結(jié)果顯示，Au4f5/2和Au4f7/2的結(jié)合能分別為87.5 eV 和83.8 eV（圖1D），表明AuNCs金核存在Au（0）和Au（I）兩種價(jià)態(tài)[18]。通過電位測定，AuNCs 的表面帶負(fù)電荷，zeta 電位為（-34.8±4.98）mV。

圖1 AuNCs的表征Figure 1 Characterization of AuNCs

2.2 AuNCs的光熱和光動(dòng)力效應(yīng)

AuNCs 的光熱效應(yīng)結(jié)果如圖2A～2C 所示。相比對照組（0 μg/mL），AuNCs 組體系溫度快速升高，并伴有顯著的濃度依賴特征。在200 μg/mL 濃度下激光照射10 min體系溫度即可升至60°C以上，10 min內(nèi)升溫幅度（ΔT）接近40°C，顯示出卓越的光熱效應(yīng)。通過連續(xù)3個(gè)升溫-降溫循環(huán)過程，體系溫度也可維持在60°C以上，表現(xiàn)出良好的光熱穩(wěn)定性。根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法計(jì)算得到AuNCs的光熱轉(zhuǎn)化效率（η）為34.4%。

圖2 AuNCs的光熱/光動(dòng)力效應(yīng)Figure 2 Photothermal effect of AuNCs

采用SOSG 測定AuNCs 不同時(shí)間1O2生成情況，以評估AuNCs的光動(dòng)力效應(yīng)，結(jié)果如圖2D～2E所示。在未施加激光照射下，體系中未檢測到1O2存在。當(dāng)激光照射后，體系中產(chǎn)生大量的1O2，1O2生成隨激光照射時(shí)間增加而升高，顯示出AuNCs良好的光動(dòng)力特征。

2.3 AuNCs對黑色素瘤細(xì)胞B16F10的毒性

AuNCs對B16F10的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖3所示。在AuNCs濃度為128 μg/mL以內(nèi)，黑色素瘤細(xì)胞與AuNCs孵育24 h 后，細(xì)胞存活率均大于85%。當(dāng)AuNCs 濃度達(dá)到256 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率為（73.2±3.1）%，與其他各濃度組細(xì)胞存活率存在差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。128 μg/mL 濃度組細(xì)胞存活率為85.9±2.4）%，與64 μg/mL 濃度組細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.57,P＞0.05）。從CCK-8 結(jié)果可以看出，在濃度為128 μg/mL以內(nèi)，AuNCs對B16F10不存在明顯的細(xì)胞毒性。

圖3 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10與不同濃度AuNCs孵育24 h后的細(xì)胞存活率Figure 3 Cell viability of melanoma cells B16F10 treated with different concentrations of AuNCs for 24 h.

2.4 808 nm 激光照射下AuNCs 對B16F10 的殺傷效應(yīng)

根據(jù)細(xì)胞毒性及光熱/光動(dòng)力效應(yīng)結(jié)果，在100 μg/mL 濃度下繼續(xù)評估AuNCs 的PTT/PDT 抗癌活性。如圖4A 所示，相比對照組，AuNCs 治療組激光照射后溫度從（26.6±0.2）°C 升高到（58.7±2.4）°C，升溫幅度超過30°C，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相應(yīng)地，AuNCs+激光照射組在激光照射后1O2產(chǎn)率顯著上升（P＜0.05），超過對照組水平的7倍（圖4B）。采用CCK-8測定了各治療組激光照射后的細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖4C 所示。相比對照組，AuNCs 治療組、激光照射組、AuNCs+激光照射組的細(xì)胞存活率分別為（88.6 ±5.6）%、（93.4±4.1）%、（38.8±2.8）%，AuNCs+激光照射組細(xì)胞存活率均顯著低于其他治療組（P＜0.05）。對照組、AuNCs 治療組、激光照射組3 組之間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，為探究PTT 和PDT 對AuNCs 抗癌活性的貢獻(xiàn)，分別以NAC 和冰浴去除1O2和熱效應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4D所示。結(jié)果顯示，添加NAC 后，細(xì)胞存活率從（38.8±2.8）%增加到（52.6± 3.8）%；而在冰浴組中，細(xì)胞的存活率為（69.3 ±3.2）%。在該體系中，AuNCs的PTT效應(yīng)對抗癌活性的影響顯著高于PDT效應(yīng)。

圖4 808 nm激光照射下AuNCs對B16F10的PTT/PDT殺傷效應(yīng)Figure 4 The PTT/PDT effects of AuNCs on B16F10 under 808 nm laser irradiation

3 討論

皮膚黑色素瘤具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性特征，其臨床治療仍是一個(gè)急需解決的難題[19]。手術(shù)切除、化療、激光療法等是目前治療皮膚黑色素瘤的主要手段，但其各自的局限性也使得治療效果不盡人意[20-21]。隨著納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種基于納米材料的黑色素瘤治療策略被提出。例如，將阿霉素負(fù)載于細(xì)胞膜納米囊泡，可顯著改善黑色素瘤細(xì)胞對阿霉素的攝入[19]。將納米金與抗腫瘤血管生成藥物恩度結(jié)合，可顯著抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移[22]。依賴普魯士藍(lán)卓越的光熱效應(yīng)，李蒙等[3]將其應(yīng)用于皮膚黑色素瘤的光熱治療，取得了顯著的療效。本文針對惡性黑色素瘤開展新型治療方法的研究，發(fā)現(xiàn)生物安全的AuNCs 對黑色素瘤細(xì)胞具有卓越的PTT/PDT 抗癌活性，有望為皮膚黑色素瘤治療提供新的策略。

AuNCs 是一類被廣泛關(guān)注的新型納米材料，在腫瘤治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景[11]。相比石墨烯等其他納米材料，AuNCs 具有卓越的生物相容性[16]。在過去的研究中，AuNCs通常僅被作為載體使用，通過負(fù)載抗癌藥物或抑癌基因發(fā)揮抗癌活性[23-24]。此外，一些AuNCs也可被作為光敏劑用于腫瘤光熱治療[25]。本研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑甲巰丙脯酸功能化的AuNCs 在808 nm 激光照射下同時(shí)具有光熱和光動(dòng)力效應(yīng)，可有效殺滅皮膚黑色素瘤細(xì)胞，其抗癌活性與其PTT/PDT效應(yīng)息息相關(guān)，顯示出誘人的應(yīng)用前景。免疫激活響應(yīng)可能是增強(qiáng)PTT/PDT 抗腫瘤的主要作用機(jī)制之一[26-27]，甲巰丙脯酸本身具有抑制腫瘤血管生成、改善腫瘤轉(zhuǎn)移的功效[12-13]。因此，進(jìn)一步開展動(dòng)物和臨床研究，深入闡釋該P(yáng)TT/PDT 體系抗皮膚黑色素瘤治療策略的療效和作用機(jī)制，對于發(fā)展新型的惡性黑色素瘤治療策略具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究以甲巰丙脯酸為功能配體通過NaOH-介導(dǎo)的NaBH4還原制備了一種在近紅外激光下同時(shí)具有光熱和光動(dòng)力效應(yīng)的AuNCs。AuNCs對小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞具有卓越的抗癌活性，且在該體系中，AuNCs的PTT效應(yīng)對抗癌活性的影響顯著高于PDT效應(yīng)。