李祥龍，陳香州，雷圍程，李立東，李 堯，楊福兵，楊曉波

1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經外科（瀘州646000）；2.四川省神經外科臨床研究中心（瀘州646000）；3.西南醫(yī)科大學 科技處（瀘州 646000）

腦梗塞是老年人群常見疾病，是人類最常見的致殘原因。大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是研究腦缺血性中風的常見動物模型[1-2]，主要用于探索發(fā)病機制及新藥研發(fā)。

在青老年兩個年齡組之間的動物對照性實驗已經用于一些藥物的研發(fā)。遺憾的是，在這些對照實驗中，兩組動物模型的腦損傷程度不一致導致了一些干預措施或治療效果的評估結果不準確。因此，一些在動物實驗中效果良好的藥物進入臨床試驗后，效果不盡人意[3-4]，動物模型的偏倚大大浪費了研發(fā)資源。本研究通過調整腦血流量的方法[5-6]，控制大鼠腦損傷程度，從而建立一種與青年大鼠神經功能損傷程度一致的老年大鼠MCAO 模型。用在青年、老年組之間的對照實驗，研究藥物療效及毒理學機理等，避免了因動物模型偏倚引起的實驗結果不準確。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物

青年雄性SPF級SD大鼠（2月齡，280～300 g）及老年雄性SPF 級SD 大鼠（20～22 月齡，750～800 g）被飼養(yǎng)在濕度（63%～65%）及溫度（23～25°C）適宜的環(huán)境里，定時喂養(yǎng)。在實驗中，使用專用動物麻醉裝置（R540，瑞沃德，中國）通過異氟烷吸入麻醉大鼠。所有實驗流程都獲得西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過（編號：KY2017035）。

1.2 通過實驗確定老年大鼠線栓規(guī)格

本研究中的MCAO 模型制作是參考LONGA 和KUTLUAY 報道的方法[7-9]。線栓經右側頸總動脈分叉處‘a’點插入頸內動脈直至大腦中動脈起點‘b’，從而阻斷大腦中動脈的血流。參考已有研究，該實驗中青年大鼠的線栓硅膠頭直徑和插入深度‘ab’分別是0.32 mm 和（18 ± 2）mm[8-10]。通過解剖15 只老年大鼠頭顱，測得‘ab’長度為（22±2）mm，見圖1A。為了獲得線栓硅膠頭直徑大小，本研究納入30 只老年大鼠，采用不同硅膠頭直徑建立3 組MCAO 模型：0.32 mm 組，0.43 mm 組，0.52 mm 組。通過術后第3 d TTC 染色，結果提示，0.52 mm 組大鼠腦梗死嚴重（45.9±5）%，0.32 mm 組腦梗死不明顯（0±1）%，0.43mm 組腦梗塞面積為（16.2±8）%，見圖1B。術后7 d 內大鼠生存率統(tǒng)計提示0.52 mm 組大鼠死亡率為80.2%，明顯高于0.43 mm組大鼠（29.6%），見圖1C。因此，0.43 mm硅膠頭更適合用于老年大鼠MCAO模型，用于后續(xù)實驗。

圖1 不同型號線栓引起老年大鼠腦梗死情況Figure 1 Degree of cerebral infarction caused by different size of suture in aged rat

1.3 建立與青年大鼠神經功能損傷程度一致的老年大鼠MCAO模型

大鼠被隨機分為4 組：青年假手術組（n=20），老年假手術組（n=20），青年MCAO 組（n=20），老年MCAO 組（n=20）。青年MCAO 組大鼠在顯微鏡下被分離右側頸動脈，并用動脈瘤夾夾閉頸總動脈，將線栓硅膠頭直徑0.32 mm、插入深度（18±2）mm插入右側大腦中動脈起始部，老年MCAO 組采用線栓硅膠頭直徑0.43 mm、插入深度（22±2）mm插入右側大腦中動脈起始部，線栓均在1 h 后取出。青年假手術組、老年假手術組行頸總動脈解剖暴露，用動脈瘤夾夾閉10 s 后松開，不塞入線栓[11]。收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、pH 值、動脈血氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）、血糖值在整個造模操作中持續(xù)監(jiān)測。

右側大腦中動脈供血區(qū)皮質的局部腦血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）通過激光多普勒血流儀（Module LDF100c Biopac Systems，Inc.，USA）持續(xù)監(jiān)測[12-13]。在大腦中動脈阻塞前、阻塞后即刻開始分別監(jiān)測5 min，阻塞前的rCBF 值作為基線值，阻塞后的rCBF 值與基線值的比值作為阻塞后腦血流量，以此用于統(tǒng)計分析。激光多普勒血流儀探頭通過一個頭皮切口放置于青年大鼠右側冠狀縫后方2 mm，旁開6 mm處（老年大鼠為右側冠狀縫后3 mm，旁開8 mm）[14-15]，通過調節(jié)線栓位置控制rCBF值。

1.4 損傷程度的一致性評價

術前、術后第1、3、7、21 d 作為神經功能評價的時間點，用改良的神經功能評分（modified Neurology Severity Score，mNSS）、角測試評估大鼠神經功能損傷情況[16-18]。mNSS采用18分評分系統(tǒng)，主要從運動、感覺、平衡、反射四方面評價，分數(shù)越高損傷越重。角測試中，將大鼠放在成30°夾角的兩塊木板間，大鼠爬進夾角后轉彎爬出，正常大鼠從左側或右側爬上木板，而腦缺血損傷的大鼠則偏向于從非癱瘓側（本實驗中為右側）爬上木板，然后轉頭返回出口。每只大鼠重復檢測10次，從右側轉向的次數(shù)記為R，從左側轉向的次數(shù)記為L，因此R+L=10，而R/R+L 則表示大鼠的癱瘓程度，值越大表示癱瘓越嚴重，值越小表示癱瘓越輕微。

通過TUNEL 試劑盒（Roche Applied Science，Germany）檢測建模后第3 d 缺血損傷區(qū)細胞死亡的情況[19-21]。大鼠腦標本在切片機上切為6 μm 厚度的切片用于檢測，共聚焦熒光顯微鏡下，通過Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，USA）系統(tǒng)計數(shù)細胞及采集圖片，每張切片取6個視野計數(shù)TUNEL-陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量資料以表示，通過單因素方差分析進行組間比較，用log-rank 檢驗進行生存率比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

通過調節(jié)線栓深度，大鼠rCBF被控制在一個穩(wěn)定的水平，青年大鼠調節(jié)為基線血流的（15±3）%，老年大鼠調節(jié)為基線血流的（25±2）%，見圖2。

圖2 各實驗組大鼠的rCBF值Figure 2 rCBF values of rats in each experimental group

通過mNSS及角測試，MCAO大鼠神經功能在腦缺血后第1 d 和第3 d 損傷明顯，且青年MCAO 組與老年MCAO 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），隨后大鼠神經功能開始恢復，但老年大鼠比青年大鼠恢復慢，21 d時，老年MCAO組神經功能比青年MCAO組差，見圖3。

圖3 mNSS及角測試對大鼠的神經功能評估Figure 3 Neurological function of rats was evaluated by mNSS and Corner test

術中監(jiān)測顯示，4 個實驗組大鼠的SBP、pH 值、PaO2、PaCO2、血糖值在MCAO 術前、術后無明顯波動，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠術中生理參數(shù)對比Table 1 Comparison of physiological parameters in each group during operation

TUNEL 試劑盒檢測結果顯示，在缺血損傷后第3 d，青年MCAO 組、老年MCAO 組腦梗死區(qū)域的細胞死亡率（青年MCAO 組為31%，老年MCAO 組為32%）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 大鼠腦梗塞區(qū)域細胞死亡情況Figure 4 Cell death in cerebral infarction area of rats

3 討論

嚙齒類動物MCAO 模型由于其操作簡便、成本低廉，被廣泛用于腦缺血疾病的研究[22-24]。該模型能模擬人類缺血性腦中風的病理生理過程，且腦缺血損傷程度可控，無需開顱操作避免了腦組織機械性損傷[14，25-26]，減少了動物模型導致的實驗結果偏倚。然而，現(xiàn)有的研究多數(shù)都使用的青年嚙齒類動物，特別是在青老年群體對比性研究中，缺乏兩年齡段損傷程度一致的模型，導致實驗結果評估不準確。人腦缺血性中風后，腦水腫在發(fā)病后3～7 d內最嚴重，神經功能缺失也最明顯[27]，這反映了早期腦損傷的嚴重程度，直接決定后期神經功能的恢復情況。本文建立青年、老年兩年齡組大鼠神經功能損傷一致的MCAO 模型，能模擬人腦3～7 d神經功能缺失最嚴重的狀態(tài)。該模型可用于早期藥物干預效果及機制研究，直接觀察干預手段對兩個年齡組個體的作用差異及其機理，避免兩組模型損傷程度差異造成的結果偏倚。

在本研究中，通過調節(jié)rCBF 控制腦缺血損傷程度，建立青年、老年兩年齡組大鼠術后3 d 內神經功能損傷程度一致的MCAO 模型，克服了以往研究中該模型的缺點。本研究分兩部分完成，線栓硅膠頭直徑和插入深度是最關鍵的參數(shù)，以往研究中沒有相關文獻，第一部分實驗通過探索獲得了較為理想的老年大鼠線栓相關數(shù)據(jù)：硅膠頭直徑0.43 mm，插入深度為（22 ±2）mm。第二部分實驗中，通過調節(jié)rCBF，建立兩年齡組損傷程度相同的MCAO模型。

以前研究報道，在青年大鼠MCAO模型中，rCBF一般降低至基線值的30%可以獲得比較合適的腦損傷程度[14-15]。本研究通過調整線栓的位置來控制rCBF 大小，結果發(fā)現(xiàn)，在兩個年齡組中，不同的rCBF可以獲得一致的神經功能損傷程度，可能是青年大鼠比老年大鼠有更強的腦缺血代償能力所致。結果顯示青年及老年MCAO組大鼠在手術后1、3 d神經功能損傷嚴重，且程度一致，之后開始逐漸恢復，老年大鼠恢復更差。青年假手術組、老年假手術組rCBF分別降低為基線值的94.9%、92.5%，可能是頸動脈夾閉后血管痙攣所致。術中生命體征持續(xù)監(jiān)測結果顯示SBP、pH、PaO2、PaCO2、血糖值在線栓插入前后無明顯差異，提示該實驗中線栓型號合適，能在維持穩(wěn)定的生命體征前提下獲得理想的腦梗塞程度。在缺血損傷后第3 d，TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)青年MCAO組與老年MCAO組腦梗死區(qū)域的細胞死亡率相同，證明本研究方法能在病理層面做到損傷程度一致，為以后腦中風機制研究提供了參考依據(jù)。

4 結論與啟示

本研究成功建立了神經功能損傷程度相同的青年、老年大鼠MCAO模型，可避免因動物模型偏倚引起的腦缺血藥物療效及毒理學機理等研究的實驗結果不準確。但本研究中使用的大鼠年齡及重量是有限定要求的，其他年齡及重量的大鼠還需要進一步實驗證明，這也是本研究的局限性。