石秋艷 李冠一 楊斌 王翠蘭 李弘 閆玉敏 何靜遠(yuǎn)

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河北唐山 063000

腦梗死目前已成為我國居民(尤其是農(nóng)村人群)死亡的首要病因,其發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率高,且發(fā)病呈年輕化趨勢[1-2]。在一定時間腦梗死恢復(fù)血液供應(yīng)后,其功能不僅未能恢復(fù),還出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙,稱為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)。CIR發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,主要與興奮性氨基酸的過度釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基產(chǎn)生和血腦屏障的功能障礙有關(guān)[3]。當(dāng)腦梗死發(fā)生時,谷氨酸等大量的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增加,從而導(dǎo)致鈣快速涌入和興奮毒性誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡[4]。他侖帕奈(Talampanel,TAL)是一種新型非競爭性AMPA受體拮抗劑,易透過血腦屏障,可通過減少Ca2+的過度內(nèi)流,降低谷氨酸的興奮毒性,改善神經(jīng)功能,減少組織損傷和細(xì)胞死亡。TAL仍處于三期臨床試驗(yàn)階段,可用于抗癲癇治療,但其對腦缺血再灌注后的神經(jīng)保護(hù)作用,國內(nèi)相關(guān)研究仍較少。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注模型,在不同時間段應(yīng)用他侖帕奈,觀察其對大鼠缺血側(cè)半球梗死體積、梗死灶周圍半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)以及血清炎性因子血清腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)濃度的影響,探討其在腦缺血再灌注后的神經(jīng)保護(hù)作用,為缺血性腦血管病的神經(jīng)保護(hù)治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠90只,雄性,單只體質(zhì)量180g,由北京華阜康生物科技股份有限公司出售,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所進(jìn)行質(zhì)量檢測,華北理工大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購置,動物證號:SCXK(京)2020-0004,在安靜環(huán)境條件下給予標(biāo)準(zhǔn)飲食及自由飲水進(jìn)行1～2周適應(yīng)性飼養(yǎng)。術(shù)前12h禁食,2h禁水。本研究經(jīng)醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗Caspase-3抗體;水合氯醛(上海恒遠(yuǎn)大生物科技有限公司);TTC染液、過氧化氫(上海信裕生物科技有限公司);TAL(愛必信上海生物科技有限公司);免疫組化試劑盒(白介素-1β、TNF-a,北京生東科技有限公司)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 尼龍線栓、動物線栓切片機(jī)(瑞沃德生命科技有限公司);KD2508石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司);SM-150D超聲波細(xì)胞破碎儀(南京舜碼醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司);大鼠腦立體定位儀(上海玉研儀器設(shè)備有限公司);電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱(上海培因儀器有限公司);烤片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動物分組 利用抽簽法隨機(jī)將90只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組),MCAO模型組,TAL治療0h、1h、3h、5h組,每組均為15只。

1.4.2造模方法 術(shù)前對SD大鼠禁水2h,并停止喂養(yǎng)飼料12h,實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前腹腔內(nèi)注入水合氯醛(3.5 mg/kg)。麻醉成功后采用改良 Longa線栓法[5]制作大鼠CIR模型,采用尼龍線栓阻塞大鼠右側(cè)大腦中動脈,制備大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。缺血2h后拔線實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組只進(jìn)行麻醉和血管分離術(shù),不結(jié)扎血管及導(dǎo)入線栓,其余手術(shù)過程相同。術(shù)后大鼠保溫,維持大鼠核心體溫在 36℃～ 37℃。

1.4.3給藥時間及劑量 大鼠 MCAO模型制備成功后,TAL治療組經(jīng)尾靜脈在復(fù)灌后不同時間點(diǎn)注射TAL(12mg/kg),Sham組和模型組給予等量生理鹽水處理。

1.4.4腦梗死體積的測定 給藥24h后,將各組大鼠全部麻醉至死,然后迅速取出大腦,并切除嗅球、小腦和下腦干。提取腦組織在 -20℃下冷凍20min。從額極開始,腦組織按照從前到后的順序以1mm間隔的冠狀位切片。將腦片浸泡在2% TTC 溶液中,37℃孵育30min。最后將腦組織切片固定于10% 甲醛溶液中過夜,溫度維持在4℃,腦片白色部分為梗死區(qū),紅色部分為非梗死區(qū)。用Image-Pro Plus 6.0軟件對每個腦切片的白色區(qū)域進(jìn)行3次檢查,得出平均值。干濕比重法測定腦梗死體積。

1.4.5石蠟切片的制備 腦組織切片厚度約為4mm,同一部位的每個標(biāo)本保存4片,然后將切片置于溫水中,溫度約為40℃,將蠟完全壓平,最后固定在載片上。玻片在60℃的恒溫箱中干燥,用水沖洗3次,蘇木精染色10min。用水沖洗3次后,切取載玻片,先用1% HCL分化,然后浸泡在1% 曙紅溶液中,最后用乙醇脫水,二甲苯透明2次,用中性樹脂封閉載玻片,光鏡下觀察海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元。

1.4.6免疫組化檢測梗死周圍區(qū)Caspase-3的表達(dá)及存活神經(jīng)元數(shù)量測定 制備的大鼠石蠟切片脫蠟后,在3% H2O2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)10min。在高溫高壓條件下暴露抗原30min,冷卻至室溫,切片干燥,用山羊血清覆蓋非特異性抗原,在37℃下孵育20min。然后加入單克隆兔抗 NeuN抗體(1:400)和兔抗 Caspase-3抗體(1:200) ,使抗原與抗體充分反應(yīng)?？乖涂贵w在4℃溫度下隔夜固定,在培養(yǎng)箱中孵育30min,然后用 PBS溶液沖洗3次,切片干燥后滴入二抗在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。用PBS溶液沖洗剩下的抗體。玻片干燥后,加入顯色劑,室溫培養(yǎng)10min,然后用PBS溶液沖洗多余的污漬。高倍顯微鏡下觀察半暗帶缺血區(qū) Caspase-3的表達(dá)及存活神經(jīng)元數(shù)量。

1.4.7免疫組化試劑盒檢測血清 TNF-α 和 IL-1β水平 給藥24h后,各組大鼠麻醉至死,迅速取出大腦,切除嗅球、小腦和下腦干。取手術(shù)側(cè)腦組織,稱重后用4℃生理鹽水制成10%腦組織勻漿。勻漿液經(jīng) 3500 r/min 離心15min,r=8cm,取上清液移入 EP 管,-20℃的冰箱中保存,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定腦組織 TNF-α和 IL-1β的表達(dá)水平。

1.4.8神經(jīng)功能損傷評分(Longa評分) 根據(jù)Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)功能缺陷;1分:癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展;2分:行走時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時向癱瘓側(cè)傾倒;4分:不能自動行走,存在意識喪失現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死體積、Longa評分及存活神經(jīng)元比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sham組大鼠神經(jīng)功能正常,Longa評分0分,未見腦梗死灶。TAL各治療亞組及MCAO組出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺失,在大腦中動脈供血區(qū)出現(xiàn)大小不等的梗死灶,主要位于額葉、頂葉和顳葉。與MCAO組相比,TAL各治療亞組中NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量較多,梗死體積減小,神經(jīng)功能評分改善(P<0.05),其中,相比于5h組,0h組、1h組、3h組梗死灶體積明顯減小(P<0.05)。見表1、圖1～3。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組鼠腦梗死體積的比較

圖2 各實(shí)驗(yàn)組鼠Longa評分比較

圖3 各實(shí)驗(yàn)組鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)比較

表1 各組大鼠腦梗死體積、Longa 評分、NeuN 陽性細(xì)胞比較

2.2各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變比較 Sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊,形態(tài)完整,大部分細(xì)胞胞質(zhì)豐富,核仁清晰,染色質(zhì)分布均勻;而MCAO組及TAL各治療亞組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元細(xì)胞紊亂、胞核固縮、碎裂甚至神經(jīng)細(xì)胞壞死。與MCAO組相比,TAL -0h組神經(jīng)元細(xì)胞排列較松散,有少量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤,少量核固縮現(xiàn)象;TAL-1h組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)較多核固縮現(xiàn)象;TAL-3h組神經(jīng)元細(xì)胞損失多,核固縮現(xiàn)象明顯,組織間存在輕度水腫變性;TAL-5h組神經(jīng)元細(xì)胞核固縮現(xiàn)象多見,小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤顯著,組織間水腫變形明顯。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)比較(HE 400×)

2.3各組實(shí)驗(yàn)大鼠梗死周圍區(qū)Caspase-3及血清炎性因子水平情況比較 在Sham組中的大鼠缺血半暗帶只有極少量Caspase-3陽性細(xì)胞,血清炎性因子水平較低;但在MCAO組及各TAL治療亞組中,可以見到缺血半暗帶Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量及血清炎性因子水平明顯高于正常,與Sham組大鼠比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);另TAL0-3h組相比于MCAO組及TAL-5h組,可見缺血半暗帶Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少,血清炎性因子明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);此結(jié)果提示TAL能夠減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)病灶周圍及其伴隨的全身炎性反應(yīng),在給藥時間3h內(nèi)效果明顯。見表2、圖5～8。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組鼠caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較

圖6 各實(shí)驗(yàn)組鼠TNF-a表達(dá)水平的比較

圖7 各實(shí)驗(yàn)組鼠IL-1β表達(dá)水平的比較

圖8 各組大鼠梗死周圍區(qū) Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)比較(免疫組化 400×)

表2 各組大鼠腦梗死梗死周圍區(qū)Caspase-3及血清炎性因子水平比較

3 討論

谷氨酸(glumate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),能夠介導(dǎo)大腦皮層和海馬等部位的興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)[6],當(dāng)其水平病理性升高時,亦可作為一種神經(jīng)毒素誘導(dǎo)嚴(yán)重的神經(jīng)元損害[4]。Glu對神經(jīng)細(xì)胞的過度興奮或過度刺激都將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡,在外源性和內(nèi)源性配體的激活下,Glu受體招募其適配蛋白,激活下游的激酶,從而誘導(dǎo)促凋亡基因的表達(dá)[7],這種病理過程被稱為Glu的神經(jīng)毒性[4],而此病理過程幾乎出現(xiàn)在所有神經(jīng)系統(tǒng)疾病中[8-9]。Glu受體包括NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸受體)和非NMDA受體,后者又包括AMPA受體(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體)和海人草氨酸受體[10]。在缺血性腦卒中中,細(xì)胞外Glu在缺血后迅速升高,再灌注后下降,而AMPA受體參與Glu介導(dǎo)的興奮性損傷,其造成的Ca2+通透性增強(qiáng)能介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡。同時,AMPA受體有活性是NMDA受體興奮的前提,阻斷Glu受體能夠顯著降低或者抑制興奮性突觸活動,減少鈣穩(wěn)態(tài)失衡造成的神經(jīng)元損傷[11],這也是AMPA受體拮抗劑可減少神經(jīng)元損傷的可能機(jī)制之一。

TAL是一種苯二氮卓類的衍生物,是AMPA受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑,這意味著與競爭性拮抗劑相比,此藥可能更具有優(yōu)勢,尤其在Glu突觸強(qiáng)烈活動的癲癇發(fā)作[12],或者在與大量細(xì)胞外Glu釋放相關(guān)的缺血事件及其他腦損傷期間[13]。有研究發(fā)現(xiàn),TAL對頸動脈缺血大鼠有腦保護(hù)作用[14]。相對于阻斷NMDA受體,阻斷AMPA受體效果更為顯著,同樣AMPA受體在神經(jīng)元過度放電的過程中起到重要的作用。本研究的目的則是評價非競爭性AMPAR拮抗劑TAL在大鼠MCAO模型中的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果提示,非競爭性AMPA受體拮抗劑TAL在大鼠腦缺血再灌注后能顯著減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,減少神經(jīng)元凋亡,尤其提示用藥越早,神經(jīng)保護(hù)作用越顯著,在缺血再灌注后5h內(nèi)給藥效果良好,超過5h給藥效果不佳。

目前已知Caspase-3在再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡中起著十分重要的作用[13],是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)與執(zhí)行者。已有證據(jù)表明,抑制Caspase-3的活化可以減輕腦缺血后的細(xì)胞損傷,增加神經(jīng)元的存活數(shù)量,并有效改善神經(jīng)功能[14]。因此Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可忽視的作用,其在局部的表達(dá)程度,代表了局部炎癥反應(yīng)的劇烈程度。在包括缺血性卒中的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放改變亦參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)限制性炎癥反應(yīng)。IL-1β和TNF-a是兩種有效的炎性細(xì)胞因子,在許多動物模型中被證明能夠調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)的缺血性損害的大小[15]。這些細(xì)胞因子可以直接作用于缺血神經(jīng)元,從而促進(jìn)腦梗死的進(jìn)展[16]。TNF-α 和IL-1β缺乏的小鼠腦梗死體積縮小的研究結(jié)果也支持炎性細(xì)胞因子水平影響中風(fēng)梗死的證據(jù)[17]。IL-1β對CIR的機(jī)制可能是激活內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致血栓形成,或誘導(dǎo)細(xì)胞間粘附分子表達(dá)增加,從而使大量中性粒細(xì)胞浸潤到腦組織中,誘發(fā)炎性發(fā)應(yīng)[18];TNF-α可以引起多核白細(xì)胞聚集和激活并釋放炎性介質(zhì),是腦梗死形成的主要原因[19]。在整個機(jī)體的一系列炎癥反應(yīng)中,TNF-a、IL-1β作為T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性因子,參與免疫應(yīng)答過程,其在血清中的含量代表了不同時間和不同個體的炎癥反應(yīng)程度,間接反應(yīng)了腦損傷的程度。本研究證實(shí)了Caspase-3以及這些炎性細(xì)胞因子在MCAO模型中的表達(dá)增加,這與已有研究一致[20-21],而TAL各治療組腦組織梗死體積縮小、血清Caspase-3表達(dá)以及TNF-a、IL-1β水平降低。

Glu誘導(dǎo)的興奮性毒性在谷氨酸受體過度刺激時迅速發(fā)展[22]。因此,Glu拮抗劑可能只在缺血開始后和再灌注后的短時間內(nèi)作為神經(jīng)保護(hù)劑有效,這一理論與我們目前的結(jié)果相符。治療3h內(nèi),TAL在局灶性MCAO模型中產(chǎn)生了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,而延遲至缺血后5h,其神經(jīng)保護(hù)作用并不顯著。目前用于急性缺血性卒中的治療包括靜脈溶栓以及血管內(nèi)機(jī)械取栓治療,可在腦卒中早期實(shí)現(xiàn)閉塞血管的再通,時間越早效果越顯著。這說明TAL與靜脈溶栓藥物rt-PA合用可能延長藥物治療的治療窗,對早期拯救缺血半暗帶區(qū)、減少神經(jīng)元細(xì)胞的損傷有協(xié)同作用,且干預(yù)越早給患者帶來的益處越大。

綜上所述,TAL能夠減少Caspase-3的表達(dá)及血清炎性因子TNF-a、IL-1β水平,減少神經(jīng)元凋亡及全身炎癥反應(yīng),增加腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量,對血管再通后的再灌注腦損傷有很好的保護(hù)作用;且其作用效果與用藥時間有關(guān),腦灌注損傷后早期用藥效果更優(yōu)。這種作用機(jī)制可能是通過抑制急性缺血、缺氧腦組織中高濃度的Glu對AMPA受體的過度激活、抑制神經(jīng)元的過度興奮、減輕局部及全身炎癥反應(yīng),進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)的作用。