劉慧莉, 陳 垣, 郭鳳霞, 周 洋, 成志強(qiáng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心, 蘭州 730070;2.平?jīng)鍪嘘P(guān)山林業(yè)管理局, 甘肅 平?jīng)?744100)

黨參[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]為桔?？?Campanulaceae)黨參屬多年生草本植物,以干燥根入藥,具有健脾益肺,養(yǎng)血生津的功效[1],是我國(guó)常用的補(bǔ)益藥之一。甘肅黨參的種植面積占全國(guó)黨參種植面積的90%左右,于2012年隴西白條黨參獲中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品(國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理局,商標(biāo)號(hào)4891422)[2-3]。黨參種質(zhì)資源豐富,近緣品種較多。近年來(lái),由于品種間的相互引種、調(diào)種,使得種質(zhì)資源混亂,群體間生物學(xué)混雜,這不僅影響種子的質(zhì)量也影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。

黨參以種子繁殖,研究其開(kāi)花習(xí)性、花部特征、花粉活力、柱頭可受性等對(duì)育種和種子生產(chǎn)具有重要意義。有性生殖過(guò)程中,植物的生物學(xué)特性與其傳粉機(jī)制相適應(yīng),大量有活力的花粉、有效的傳媒和可授期的柱頭是植物生殖成功的前提,繁育系統(tǒng)直接影響后代遺傳組成,其中交配系統(tǒng)是核心[4]。已有學(xué)者對(duì)暗紫貝母[5]、菘藍(lán)[6-7]、直緣烏頭[8]、黃蓮花[9]等藥用植物的繁育系統(tǒng)進(jìn)行了深入的研究,為藥用植物育種提供了科學(xué)依據(jù)。本研究從開(kāi)花動(dòng)態(tài)、花粉活力、柱頭可授性、人工授粉和套袋試驗(yàn)等方面研究黨參的繁育系統(tǒng),為黨參品種選育及優(yōu)良品種的提純復(fù)壯提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于甘肅省隴西縣首陽(yáng)鎮(zhèn)隴西藥鋪園(35°5′22″N,104°24′44″E),海拔1 912 m,年均氣溫7.7 ℃,年均降水量450 mm,降水集中在8—9月,年均日照時(shí)數(shù)292 h,年均無(wú)霜期142 d,土壤質(zhì)地為黃綿土。

本試驗(yàn)材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的新品系兩年生健康、無(wú)病蟲(chóng)害的植株“甘黨1號(hào)”。

1.2 開(kāi)花動(dòng)態(tài)觀察

觀察黨參花的形態(tài)特征并且在黨參整個(gè)生殖生長(zhǎng)期內(nèi)參照王艷芳[11]的方法觀察黨參花期,劃取3個(gè)3 m×3 m樣方,觀測(cè)記錄各小區(qū)內(nèi)黨參開(kāi)花動(dòng)態(tài),試驗(yàn)于7月20日開(kāi)始,每10天觀測(cè)一次,按表1標(biāo)準(zhǔn)記錄。在盛花初期,選取一定數(shù)量即將開(kāi)花的花朵進(jìn)行掛牌標(biāo)記,每隔2 h觀察一次,記錄其開(kāi)花狀態(tài)及柱頭與雄蕊位置變化情況。根據(jù)觀察結(jié)果將黨參花劃分等級(jí)。

表1 黨參開(kāi)花進(jìn)程Table 1 The flowering process of Codonopsis pilosula

1.3 花粉活力測(cè)定

采用0.5%TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)法測(cè)定其花粉的活力。選取各等級(jí)的花朵,用鑷子小心夾取每朵花中的花藥,分別置于載玻片上,并用鑷子搗碎花藥散出花粉,加1～2滴配制好的TTC溶液,蓋上蓋玻片,放置在室溫且黑暗處10～15 min,隨后置于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉粒的染色情況。根據(jù)花粉染色情況判定花粉的活力,花粉粒被染為紅色,表明花粉活力最強(qiáng);淡粉色表明花粉活力次之;無(wú)色或綠色時(shí)表明花粉無(wú)活力。每一等級(jí)花選取3朵進(jìn)行觀察,每次觀察5個(gè)視野并統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)花粉?？倲?shù)以及紅色、淡粉色花粉粒數(shù)目,最后計(jì)算不同級(jí)別花朵的花粉活率。

花粉活率/%=[(紅色花粉粒數(shù)+淡粉色花粉粒數(shù))/花粉粒總數(shù)]×100%;

強(qiáng)活力花粉率/%=(紅色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%;

弱活力花粉率/%=(淡粉色花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù))×100%。

1.4 柱頭可受性測(cè)定

參照Dafni等[10]的方法(聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法)測(cè)定柱頭可受性。用鑷子小心摘取各等級(jí)花的柱頭并放置于單凹面載玻片上,將含有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫的反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過(guò)氧化氫∶水=4∶11∶22)滴在柱頭上,使柱頭浸在反應(yīng)液中,隨后將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察柱頭周?chē)a(chǎn)生氣泡的數(shù)量與速度,氣泡越多、速度越快說(shuō)明柱頭的可受性越強(qiáng),反之柱頭可受性越低,沒(méi)有氣泡產(chǎn)生則表明該階段的柱頭不具有可受性。每一等級(jí)選取3個(gè)花朵進(jìn)行觀測(cè),每一裝片觀察統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。

1.5 傳粉方式研究

在盛花期對(duì)黨參花做以下9個(gè)處理:

1) 自然授粉:不去雄,不套袋,僅掛牌標(biāo)記,檢測(cè)自然條件下果實(shí)的結(jié)實(shí)率;

2) 不去雄套紙袋:在花冠還未裂開(kāi)時(shí)套紙袋,檢測(cè)其自交結(jié)實(shí)情況;

3) 去雄套紙袋:選花萼將要裂開(kāi)、但花藥未裂的花朵,去掉雄蕊,并套上紙袋,檢測(cè)是否具有融合生殖;

4) 去雄套網(wǎng)袋:選花藥未裂開(kāi)的花朵,去掉雄蕊并套上網(wǎng)袋,檢測(cè)風(fēng)媒傳粉的結(jié)實(shí)率;

5) 去雄不套袋:去掉未裂開(kāi)的雄蕊,檢測(cè)異花授粉的結(jié)實(shí)率;

6) 去雄同株異花外壁授粉:去掉還未裂開(kāi)的雄蕊,取同一植株上的另一朵花藥剛裂開(kāi)的雄蕊,將花藥涂抹在柱頭外壁上,檢測(cè)外壁和同株授粉情況;

7) 去雄異株異花外壁授粉:去雄后選取另一植株上剛裂開(kāi)的花藥進(jìn)行授粉,檢測(cè)外壁和異株授粉情況;

8) 去雄同株異花內(nèi)壁授粉:取掉雄蕊后套袋,待柱頭裂開(kāi)后,取同株花藥裂開(kāi)的雄蕊,將花粉授在柱頭的內(nèi)壁,隨后繼續(xù)套上紙袋,檢測(cè)內(nèi)壁和同株授粉情況;

9) 去雄異株異花內(nèi)壁授粉:操作步驟同8,但取異株的花粉授于內(nèi)壁上,檢測(cè)內(nèi)壁和異株授粉情況。

不同花朵之間傳粉授粉時(shí),選擇花冠和花藥都未裂開(kāi)的花朵進(jìn)行試驗(yàn),每次取花藥時(shí)都將鑷子用75%的酒精消毒,避免交叉?zhèn)鞣?以防摘取部位感染,影響結(jié)果準(zhǔn)確率。網(wǎng)袋選用網(wǎng)孔為1 mm×1 mm的尼龍篩網(wǎng),防止昆蟲(chóng)傳粉;紙袋選用透氣、透光和防水的硫酸紙袋,大小為8 cm×5 cm,套袋時(shí)用回形針將紙袋開(kāi)口處夾住,待花朵完全枯萎時(shí)取掉其紙袋,以防影響果實(shí)發(fā)育。

1.6 傳粉媒介觀察

在田間劃取3個(gè)3 m×3 m樣方,盛花期時(shí)每天每隔2 h觀察一次,持續(xù)觀察8 d,觀察傳粉的媒介以及傳粉昆蟲(chóng)出現(xiàn)的時(shí)間。

2 數(shù)據(jù)分析

2.1 開(kāi)花動(dòng)態(tài)觀察

觀測(cè)結(jié)果(表2)表明,該試驗(yàn)地于7月中旬(7月20日)開(kāi)始現(xiàn)蕾,7月下旬(7月30日)進(jìn)入初花期,開(kāi)花數(shù)小于30%,8月上旬(8月10日)進(jìn)入盛花初期,開(kāi)花數(shù)在30%～50%,盛花期在8月中旬至8月下旬,盛花期時(shí)間較長(zhǎng),大約20 d。9月中旬進(jìn)入開(kāi)花末期,開(kāi)花數(shù)量少于10%。

表2 黨參開(kāi)花時(shí)期Table 2 Flowering period of Codonopsis pilosula

黨參藤蔓較長(zhǎng),相互纏繞,莖色為綠色有些具有紫色斑紋,內(nèi)含乳白色乳汁,分枝較多?；ㄝ喽酁?裂少見(jiàn)4裂,花冠鐘狀,雄蕊5,柱頭多為3裂少見(jiàn)4裂、5裂。子房常為下位或半下位?；ü诙酁榈S色,有些具有淺紫色花紋。通過(guò)對(duì)田間黨參花朵的觀察,黨參從現(xiàn)蕾至開(kāi)花結(jié)束主要經(jīng)歷以下幾個(gè)過(guò)程,蕾期—花萼開(kāi)裂—花冠開(kāi)裂—雌蕊偏離柱頭—柱頭開(kāi)裂向下卷曲—花冠枯萎。為使開(kāi)花動(dòng)態(tài)的觀測(cè)更加直觀,用數(shù)字代表每個(gè)進(jìn)程(表3)。

表3 開(kāi)花動(dòng)態(tài)觀測(cè)Table 3 Flowering dynamic abservation

圖1 黨參花柱頭內(nèi)外壁Fig.1 Inner and outer wall of Codonopsis pilosula stigma

圖2 不同等級(jí)黨參花朵Fig.2 Different grades of Codonopsis pilosula flowers

表4 不同等級(jí)黨參花朵花粉活力的比較Table 4 Comparison of pollen vitality of different grades of Codonopsis pilosula

圖3 不同等級(jí)黨參花朵柱頭在聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液中的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of the aniline-hydrogen peroxide for different grades of Codonopsis pilosula flowers

圖4 黨參花朵傳粉媒介Fig.4 The flower pollinator of Codonopsis pilosula

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),黨參為兩性花,既有雌蕊又有雄蕊,大多黨參花冠裂開(kāi)初期,雄蕊緊貼柱頭,但花藥也伴隨裂開(kāi),花粉被釋放至柱頭上。開(kāi)花動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果表明,花萼從有小裂縫至完全裂開(kāi)需經(jīng)歷6～8 h,花冠裂開(kāi)后4～8 h雄蕊開(kāi)始偏離柱頭,隨后貼合花冠內(nèi)部并干枯,柱頭多在花冠裂開(kāi)后24 h左右開(kāi)始裂開(kāi),其單花壽命2～3 d。

2.2 花粉活力

通過(guò)觀察黨參花的開(kāi)花動(dòng)態(tài),根據(jù)花粉呈現(xiàn),柱頭裂開(kāi)及花萼、花冠展開(kāi)狀態(tài),可將不同形態(tài)的黨參花分為以下8個(gè)等級(jí):1級(jí)為蕾期,花萼將花冠完全包裹,未見(jiàn)花冠但柱頭尚未裂開(kāi);2級(jí)為花苞鼓起,花萼裂開(kāi),但未翹起;3級(jí)為花萼全部翹起,但花冠還未裂開(kāi);4級(jí)為花冠裂開(kāi),雄蕊還未偏離柱頭;5級(jí)為雄蕊偏離柱頭,但柱頭尚未裂開(kāi);6級(jí)為柱頭裂開(kāi);7級(jí)為花冠邊緣枯萎;8級(jí)為花冠完全枯萎。因黨參花具有花粉二次呈現(xiàn)的特性,4級(jí)后的花朵在柱頭上取其花粉進(jìn)行測(cè)定。

將8個(gè)不同等級(jí)花朵分別用TTC測(cè)定其花粉活力,結(jié)果顯示,在蕾期花萼未開(kāi)裂時(shí)花粉就已具有活力,為26.28%;花粉粒在花藥中不斷成熟,花粉粒總數(shù)及活率均呈直線(xiàn)上升趨勢(shì),且2級(jí)較1級(jí)弱活力花粉率極顯著增加(p<0.01)。直到花冠裂開(kāi)時(shí),花粉粒總數(shù)、強(qiáng)活力花粉粒數(shù)及花粉活力達(dá)最大(p<0.05),因4級(jí)花朵的花藥已裂開(kāi),且花藥裂開(kāi)時(shí)緊貼柱頭,因此大部分的花粉散落在柱頭上。在雄蕊偏離柱頭后(5級(jí)～8級(jí))花粉?？倲?shù)及強(qiáng)花粉粒數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì),尤其當(dāng)花冠完全枯萎時(shí),花藥已完全干枯,且柱頭外壁的花粉幾乎灑落,視野內(nèi)可以看到的花粉粒數(shù)極顯著降低(p<0.01),花粉活力率和弱活力花粉率極顯著下降(p<0.01),強(qiáng)活力花粉率在花藥裂開(kāi)后極顯著降低(p<0.01)。以上結(jié)果顯示,在黨參花朵整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,花粉?？倲?shù)、花粉活力及強(qiáng)花粉活力呈先升后降的趨勢(shì),均在4級(jí)達(dá)到最大值,是有性雜交最佳花粉采集花朵。

2.3 柱頭可受性

觀察發(fā)現(xiàn),在花蕾期,花萼未翹起時(shí),柱頭周?chē)鸁o(wú)氣泡產(chǎn)生,所以不具備可受性;等級(jí)3花朵的柱頭周?chē)糠钟猩倭繗馀莓a(chǎn)生,部分無(wú)氣泡,因此當(dāng)花萼翹起時(shí),部分花柱頭外壁開(kāi)始具有可受性;花萼展開(kāi),柱頭未開(kāi)裂時(shí),柱頭外壁周?chē)鷼馀菝黠@增多,生泡速度加快,說(shuō)明可受性明顯增強(qiáng);當(dāng)柱頭開(kāi)裂時(shí),柱頭內(nèi)外壁都有大量氣泡產(chǎn)生,而且內(nèi)壁比外壁產(chǎn)生氣泡更多,生泡速度更快,柱頭可受性更強(qiáng);黨參花朵要枯萎時(shí)柱頭外壁無(wú)氣泡產(chǎn)生,內(nèi)壁氣泡較6級(jí)有所減少。測(cè)定結(jié)果表明,黨參花朵自整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,花萼與花冠未分離時(shí)柱頭不具可受性,當(dāng)花萼、花冠展開(kāi),柱頭尚未裂開(kāi)時(shí),柱頭外壁具有可受性但可受性不強(qiáng),當(dāng)柱頭裂開(kāi)后,柱頭內(nèi)壁可受性最強(qiáng)。

綜上所述,黨參花朵在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,花朵的花粉均具有活力,在花冠開(kāi)裂前,部分花朵柱頭已具有可受性,表示黨參存在自交結(jié)實(shí)。但花粉活力最強(qiáng)是花藥和柱頭尚未分離時(shí),柱頭可受性最強(qiáng)是在柱頭開(kāi)裂時(shí),說(shuō)明同一朵黨參花雌雄蕊的強(qiáng)活力出現(xiàn)時(shí)間錯(cuò)位,以減少自花授粉的幾率。

2.4 授粉特性研究

由表5可知,在各授粉處理中不去雄套袋的結(jié)實(shí)率為9.00%,去雄不套袋的結(jié)實(shí)率為40.00%,去雄套網(wǎng)袋的結(jié)實(shí)率為10.00%,證明黨參主要是異花授粉,也可自花授粉,但自交結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)低于異花授粉的結(jié)實(shí)率,因此,黨參以異花授粉為主,但存在自交親和性;在異花授粉的過(guò)程中,昆蟲(chóng)是主要的傳粉媒介,但風(fēng)也是授粉的媒介之一。去雄套紙袋的結(jié)實(shí)率為0,則表明黨參不存在融合生殖的現(xiàn)象。同株異花外壁授粉結(jié)實(shí)率為10.00%,異株異花外壁授粉結(jié)實(shí)率為15.00%,同株異花內(nèi)壁授粉為20.00%,異株異花內(nèi)壁授粉為25.00%,證明黨參柱頭內(nèi)外壁皆可授粉,但外壁授粉后結(jié)實(shí)的成功率低于內(nèi)壁授粉,且異株授粉的結(jié)實(shí)率高于同株授粉。綜上所述,黨參存在自交結(jié)實(shí),但以異花傳粉為主,在傳粉的過(guò)程中,傳粉媒介有風(fēng)媒、蟲(chóng)媒,但昆蟲(chóng)是主要的傳粉媒介。

表5 黨參田間結(jié)實(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 Statistical results of the field fruit of Codonopsis pilosula

2.5 傳粉媒介觀察

通過(guò)田間觀察發(fā)現(xiàn),蜜蜂和蒼蠅為主的昆蟲(chóng)經(jīng)常出沒(méi)在田間,且蜂蜜出沒(méi)時(shí)可在田間聽(tīng)到清晰的嗡嗡聲,因此,通過(guò)聲音和數(shù)量可判定每天11:00—15:00時(shí)訪花的蜜蜂較多,蜜蜂訪花的原因可能與黨參花冠中花盤(pán)上的蜜腺點(diǎn)有關(guān);大部分蜂蜜在花冠中都呈頭在柱頭下的姿勢(shì),或是卷曲在柱頭下,采蜜的過(guò)程中在蜜蜂胸腹、足等位置粘有花粉。因此結(jié)合授粉套袋實(shí)驗(yàn)更加說(shuō)明,黨參傳粉媒介主要以昆蟲(chóng)傳粉為主,但也不能排除風(fēng)媒。

3 討 論

3.1 黨參花粉二次呈現(xiàn)特性

植物的花朵在傳粉過(guò)程中為了提高花粉散在柱頭上增強(qiáng)授粉的幾率,通常通過(guò)調(diào)整花粉的呈現(xiàn)形式來(lái)降低或減少花粉在傳遞過(guò)程中的損耗[12]?；ǚ鄱纬尸F(xiàn)是指花粉從花藥中散出后被釋放到另一個(gè)花器官表面,再?gòu)拇瞬课怀诗I(xiàn)給傳粉者的特征[13]。菊科、豆科、天南星科、半邊蓮科、遠(yuǎn)志科等都具有此類(lèi)特征,但不同科屬植物次級(jí)花粉的呈現(xiàn)形式不同,且Leins P,Erbar C[14]對(duì)其次級(jí)花粉呈現(xiàn)的類(lèi)型進(jìn)行了詳細(xì)的研究;張建等[15]研究了東北蒲公英次級(jí)花粉的呈現(xiàn)方式,是柱頭在延長(zhǎng)的過(guò)程中隨著柱頭下表面具刺狀的突起將花粉從聚合花藥中帶出。除植物自身特性外,動(dòng)物也是參與傳粉推動(dòng)植物花部特征進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,黨參在花冠展開(kāi)的同時(shí)也伴隨著花藥的裂開(kāi),但由于花藥緊貼柱頭,因此花藥中釋放出來(lái)的花粉大多集中于柱頭上,當(dāng)雄蕊開(kāi)始偏離柱頭時(shí),雄蕊開(kāi)始枯萎?；ǚ坩尫旁谥^上時(shí)的花粉活力最強(qiáng),此時(shí)柱頭已具有可受性,但是較弱,當(dāng)柱頭裂開(kāi)時(shí)柱頭內(nèi)壁可受性最強(qiáng),但此時(shí)的花粉活力相對(duì)減弱,結(jié)合授粉試驗(yàn)可知,不去雄套紙袋時(shí)黨參的結(jié)實(shí)率為9.00%,結(jié)實(shí)率在各項(xiàng)處理中最低,這與黨參柱頭強(qiáng)可受性及花粉強(qiáng)活力最佳時(shí)間不相交有關(guān)。因花粉二次呈現(xiàn)在柱頭上,增加了花粉傳播的途徑,異花授粉的結(jié)實(shí)率為40.00%,風(fēng)媒傳粉的結(jié)實(shí)率為10.00%,由此可知昆蟲(chóng)是主要的傳粉媒介。結(jié)合大田觀察可知,蜜蜂是主要的傳粉昆蟲(chóng),因黨參花盤(pán)的五個(gè)角都具有分泌花蜜的蜜腺點(diǎn),當(dāng)蜜蜂在采集花蜜的同時(shí)會(huì)通過(guò)柱頭帶走部分花粉。

3.2 黨參繁育系統(tǒng)為異交為主,存在自交親和性,無(wú)融合生殖

在眾多的繁育系統(tǒng)類(lèi)型中,植物的有性繁殖是通過(guò)授粉受精形成種子,進(jìn)而繁育后代的繁殖方式[17]。因此植物的繁育方式在植物的性狀遺傳和變異方面具有重要的意義[18]。絕對(duì)自交、絕對(duì)異交的植物較少,大多植物是兩種混交的模式[19]。王麗[20]研究認(rèn)為,新疆黨參不能進(jìn)行自發(fā)的自花傳粉,且自交不親和。王艷芳等[21]認(rèn)為,黨參不存在風(fēng)媒傳粉,且柱頭外側(cè)不具有可受性。本研究結(jié)果顯示,黨參在花冠未展開(kāi)前,柱頭已具有可受性及花粉具有活力,并且部分花藥已散落花粉粒于柱頭,再結(jié)合不去雄套紙袋結(jié)實(shí)率為9.00%均能說(shuō)明黨參存在自交親和,但是根據(jù)柱頭可受性的觀察以及內(nèi)外壁授粉后的結(jié)實(shí)情況,認(rèn)為黨參柱頭外壁具備可授性,并在黨參花冠及柱頭裂開(kāi)時(shí),柱頭內(nèi)外壁可受性均達(dá)到最大,此時(shí)通過(guò)傳粉媒介異花授粉結(jié)實(shí)幾率更大,與去雄不套袋結(jié)實(shí)率40%結(jié)果相一致,由此說(shuō)明黨參繁育系統(tǒng)屬于兩種混交模式,授粉結(jié)實(shí)存在自交親和性,但以異交為主。本研究還揭示,黨參去雄套紙袋不結(jié)實(shí)和去雄套網(wǎng)袋結(jié)實(shí)率僅10%,既反映出黨參風(fēng)媒傳粉的可能,也反映出黨參無(wú)法孤雌生殖。