吳永飛, 楊雪蓮, 顏 麗, 王 霞

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025)

鼠曲草(PseudognaphaliumaffineD.Don)俗名清明菜,屬菊科管狀花亞科鼠曲草屬一年生或兩年生草本植物[1]。在我國南方少數(shù)民族地區(qū)的清明節(jié)前后,采摘鼠曲草的嫩莖葉用來炒食,也可采集帶花序的莖葉拌入米面或玉米面,用來制作清明果或青餅等民族傳統(tǒng)保健特色風(fēng)味食品,故有清明菜之稱,是清明時節(jié)極具特色的野菜,其香味濃郁,味道獨特,是少數(shù)民族地區(qū)民間喜愛的時令野菜[2]。鼠曲草也是一種重要的中草藥植物,全草富含黃酮、氨基酸、維生素等多種功能性成分,營養(yǎng)價值高[3],具有祛風(fēng)、化痰、止咳等功效[4]。此外,鼠曲草具有顯著的抗菌[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、抑制酶活性[8]等作用,可用于治療高尿酸血癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性支氣管炎等疾病[9]。鼠曲草資源豐富,無毒無害,除了具有藥理作用和食用作用之外,還可用作化學(xué)農(nóng)藥和化妝品天然添加劑,常見的產(chǎn)品包括甜味劑、殺蟲劑、抗氧化劑等,是一種極具開發(fā)利用潛質(zhì)的天然資源[10]。

葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的場所,為植株生長發(fā)育提供所需物質(zhì),也是綠色植物細(xì)胞中一種重要的母體遺傳細(xì)胞器,具有獨立的圓形基因組、單獨的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運系統(tǒng),在光合作用和碳固定中起著關(guān)鍵作用[11-12]。葉綠體基因組具有較低的變異率,以及較為保守的結(jié)構(gòu)和組成,被廣泛應(yīng)用于物種保護(hù)、系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化[13]。近幾年,高通量技術(shù)的快速發(fā)展,為多種植物葉綠體基因組的檢測提供更加便捷、準(zhǔn)確、迅速的方式[14-16]。

作為用途廣泛且資源充沛的生物資源,葉綠體基因組的檢測對鼠曲草進(jìn)一步開發(fā)利用及保護(hù)具有重大的意義。但目前有關(guān)鼠曲草葉綠體基因組的研究鮮有報道。本研究以貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)宋家壩村采摘的鼠曲草為材料,利用高通量技術(shù)對其葉綠體基因組進(jìn)行測序,對其葉綠體全基因組進(jìn)行組裝注釋及相關(guān)分析,旨在為鼠曲草屬植物物種鑒定、保護(hù)及開發(fā)利用等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鼠曲草采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)宋家壩村(25°47′20″N;106°51′28″E),樣品于-80 ℃冰箱保存。

1.2 DNA的提取及測序

DNA提取按照Yang[17]的方法,從新鮮的鼠曲草葉片中提取DNA,質(zhì)檢合格的DNA,用機械打斷的方法進(jìn)行片段化處理;接著對DNA片段進(jìn)行純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇;通過PCR擴增構(gòu)建DNA文庫,質(zhì)檢合格的DNA文庫委托深圳市惠通生物科技有限公司進(jìn)行測序。剩余DNA保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室(編號GDQMC 01)。

1.3 鼠曲草的葉綠體基因組組裝、注釋

使用CLC Genomics Workbench v 8.0軟件組裝鼠曲草葉綠體基因組。使用DOGMA和Geneious軟件對葉綠體基因組進(jìn)行注釋[18-20],注釋良好的鼠曲草葉綠體基因組提交至GenBank,登錄號為NC_060507。使用OGDRAW軟件[21]制作鼠曲草葉綠體基因組完整圖譜。

1.4 密碼子偏好性分析和重復(fù)序列分析

運用CodonW 1.4.2軟件[22]統(tǒng)計分析鼠曲草葉綠體基因組密碼子的偏好性。利用Reputer軟件[23]對鼠曲草葉綠體基因組的散在重復(fù)序列進(jìn)行檢測,最小重復(fù)長度設(shè)置為30,最小排列值為50,最多堿基錯配為3。利用MISA軟件[24]檢測鼠曲草葉綠體基因組的簡單重復(fù)序列,單核苷酸的最小重復(fù)值設(shè)置為10、二核苷酸設(shè)置為5,三核苷酸設(shè)置為4,四、五、六核苷酸均設(shè)置為3。

1.5 鼠曲草葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了與鼠曲草親緣關(guān)系相近的13個物種(管狀花亞科)葉綠體基因組序列,包括三裂葉豚草(NC_036810.2)、香青(NC_034648.1)、橫斜紫菀(MK 290823.1)、野菊花(JN 867592.1)、香絲草(NC_035884.1)、菊芋(MG 696658.1)、蠟菊(NC_041458.1)、葫蘆花(NC_034819.1),火絨草(NC_027835.1)、小濱菊(MG 748695.1)、鹿蹄橐吾(NC_039381.1)、銀黨參(NC_013553.1)和瓜葉菊(NC_031898.1),并將舌狀花亞科的萵苣(DQ 383816.1)和菊苣(MK 569377.1)作為外類群參與系統(tǒng)進(jìn)化分析。經(jīng)多重比對后,利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;自舉檢測值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠曲草葉綠體全基因組特征分析

鼠曲草葉綠體基因組(Genbank登錄號NC_060507)大小為153 103 bp,具有典型的四分體結(jié)構(gòu)特征,即一個大單拷貝區(qū)(LSC),一個小單拷貝區(qū)(SSC)和一對反向重復(fù)序列(IRs)(圖1)。

圖1 空心泡葉綠體基因組圖譜Fig.1 Complete chloroplast genome map of P. affine

鼠曲草葉綠體基因組LSC區(qū)長度為85 064 bp,SSC長度為18 509 bp,IRs區(qū)長度為24 765 bp,全基因組的GC含量為37.1%。共編碼了113個獨特的基因,其中蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因和tRNA基因分別為80、4、29個(表1)。

表1 鼠曲草葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征Table 1 Structural characteristics of P. affine chloroplast genome

根據(jù)功能的不同可以將這些基因分為:自我復(fù)制相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因、其他基因和未知功能基因(表2)。鼠曲草113個獨特基因中有19個基因在反向重復(fù)區(qū)復(fù)制,包括全部4種rRNA基因,tRNA基因:trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC和蛋白編碼基因:rpl2、rpl23、rps7、ndhB、ycf1、ycf2、ycf15。此外,trnA-UGC、rpoC1、rps16、rpl2等14個基因具有1個內(nèi)含子,clpP和ycf3具有2個內(nèi)含子,大部分基因不具內(nèi)含子,rps12基因存在反式剪接。

表2 空心泡葉綠體基因組注釋基因信息Table 1 Annotation gene information in the chloroplast genome of P. affine

2.2 鼠曲草葉綠體基因組重復(fù)序列分析

由表3可知,鼠曲草葉綠體基因組中共鑒定出48個4種不同類型的散在重復(fù)序列,其中有19個正向重復(fù)(39.58%),3個反向重復(fù)(6.25%),1個互補重復(fù)(2.08%)和25個回文重復(fù)(52.83%)。其中回文重復(fù)占比最大,互補重復(fù)占比最小。除個別重復(fù)序列較長外(24 765 bp、105 bp),4種重復(fù)序列的長度主要集中在30～60 bp之間。各重復(fù)序列在基因編碼區(qū)(ndhA、ndhB、psaA等)、基因間隔區(qū)(rps19-rpl2、petN-psbM、psbC-trnS-UGA等)、tRNA(trnG-UCC、trnS-GGA)和ycf3基因內(nèi)含子區(qū)域均有分布,以ycf2基因中出現(xiàn)的序列最多(表3)。

表3 鼠曲草葉綠體基因組的重復(fù)序列Table 3 Repetitive sequences of chloroplast genome of P. affine

2.3 鼠曲草葉綠體基因組SSR分析

鼠曲草葉綠體基因組中共鑒定了74個9種不同序列的SSR位點,SSR重復(fù)類型從單核苷酸到五核苷酸均有包含,重復(fù)次數(shù)分別為31、10、13、19、1,未鑒定出六核苷酸(表4)。單核苷酸序列重復(fù)次數(shù)最多,占所有SSR位點的41.89%,且全部為A/T重復(fù)序列,無C/G重復(fù)序列。此外,該物種的SSR位點主要是由堿基A和堿基T組成的(68個),占所有SSR位點的91.89%。

表4 鼠曲草葉綠體SSR信息Table 4 SSR information in chloroplast of P. affine

2.4 鼠曲草密碼子偏好性分析

利用CodonW統(tǒng)計鼠曲草葉綠體基因組密碼子使用情況,結(jié)果表明,鼠曲草葉綠體基因組含有64種密碼子,總密碼子數(shù)為51 034個,這些密碼子共編碼了22種氨基酸(表5)。其中,亮氨酸(10.21%)出現(xiàn)頻率最高,色氨酸(1.39%)出現(xiàn)的頻率最低,而使用頻率最高和最低的密碼子分別是AGA(RSCU=2.10)和CGA(RSCU=0.47)。在所有密碼子中,RSCU>1的密碼子有31個,其中14個密碼子以A結(jié)尾,13個密碼子以U結(jié)尾,而僅有4個以C/G結(jié)尾,說明鼠曲草葉綠體基因組偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子。

表5 鼠曲草各氨基酸相對同義密碼子使用度Table 5 Relative synonymous codon usage in each amino acid of P. affine

2.5 鼠曲草葉綠體全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

以鼠曲草、13個管狀花亞科植株和2個來自舌狀花亞科植株(作為外群)的葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以評價鼠曲草與其他植物之間的進(jìn)化關(guān)系。管狀花亞科14個物種構(gòu)成一個單系類群,該單系類群被分為5個小的類群,香青、蠟菊、鼠曲草和火絨草為一個類群,屬于旋覆花族;小濱菊和野菊花為一個類群,屬于春黃菊族;葫蘆花、香絲草和橫斜紫菀為一個類群,屬于紫菀族;瓜葉菊和鹿蹄橐吾為一個類群,屬于千里光族;菊芋、銀黨參和三裂葉豚草為一個類群,屬于向日葵族;作為外群的兩個舌狀花亞科物種為一個類群,屬于萵苣族。鼠曲草與香青和蠟菊構(gòu)成的單系分支互為姊妹類群,且它們構(gòu)成的單系分支與火絨草互為姊妹類群。所有菊科植物中,鼠曲草與香青、蠟菊和火絨草的關(guān)系最為密切(圖2)。本研究獲得的鼠曲草葉綠體基因組為深入研究管狀花亞科植物物種之間的進(jìn)化關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

圖2 基于菊科16個物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16 species of compositae

3 討 論

目前鼠曲草的研究主要在功能性成分的提取和藥理作用等方面[25-26],對其物種進(jìn)化和葉綠體基因組研究較少。葉綠體是綠色植物最重要的細(xì)胞器之一,其基因組是獨立且完整的[27],鼠曲草葉綠體基因組的研究補充了鼠曲草遺傳背景等相關(guān)信息。不同植物其葉綠體基因組長度不同,高等植物一般在120～180 kb以間,通?？删幋a100～130個特異基因,葉綠體基因組在基因內(nèi)容和基因組結(jié)構(gòu)上高度保守[28]。梁鳳萍等[29]對已報道的菊科植物葉綠體全基因組序列進(jìn)行了統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)菊科植物葉綠體基因組長度在149 510～153 202 bp之間,基因組總GC含量為30%～40%,葉綠體總基因數(shù)量在106～138之間。本研究發(fā)現(xiàn),鼠曲草葉綠體基因組大小為153 103 bp,GC含量為37.1%,共編碼113個基因(19個在IR區(qū)重復(fù)),包括80個蛋白質(zhì)編碼基因、4個rRNA 和29個tRNA。這與在馬錢子[30]、橫斜紫菀[31]和蜈蚣草[32]等菊科植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征基本類似,說明葉綠體基因組高度保守[33]。

重復(fù)序列會導(dǎo)致葉綠體基因組的重排,改變基因組的結(jié)構(gòu),在葉綠體基因組的進(jìn)化中發(fā)揮著重要的作用[34]。本研究鑒定了48個散在重復(fù)序列,4種重復(fù)類型均被檢測出來,以回文重復(fù)占比最大,大多數(shù)重復(fù)序列分布在基因間隔區(qū)和ycf2基因中,這與Yan等[35]在豆瓣菜的研究結(jié)果類似。同時,檢測到74個9種不同類型的SSR位點,其中單核苷酸重復(fù)序列占比最大,且均表現(xiàn)為A/T型,具有很強的A/T偏性,這與在匙葉紫菀[36]中的研究結(jié)果相似,原因是SSR通常由短聚腺嘌呤或多胸腺嘧啶重復(fù)序列組成。鼠曲草葉綠體基因組重復(fù)序列的解析,為鼠曲草屬植物的鑒定和進(jìn)一步的演化研究提供參考。

密碼子偏好性是指同義密碼子使用不均衡的現(xiàn)象,在生物體基因組進(jìn)化過程中扮演重要作用,通常以同義密碼子使用頻率(RSCU)來反映密碼子使用情況[37]。鼠曲草葉綠體基因組中共有22種氨基酸被64種密碼子編碼,其中編碼Leu的密碼子最多(5 209, 占10.21%),編碼Trp的密碼子最少(707, 占1.39%)。RSCU分析表明,RSCU值最大和最小的密碼子分別是AGA(2.10)和CGA(0.47),且均是編碼Arg的密碼子;各密碼子中,RSCU值大于1的有31個,其中27個以A/U結(jié)尾,說明鼠曲草葉綠體基因組偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子,這種密碼子使用偏性現(xiàn)象與獼猴桃[38]類似。

目前有關(guān)菊科植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究越來越廣泛[39-40]。為確定鼠曲草在菊科植物中的進(jìn)化地位和親緣關(guān)系,選取15種菊科物種,以萵苣和菊苣作為外類群進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。研究表明,鼠曲草與香青和蠟菊構(gòu)成的單系分支聚為同一分支,再與火絨草聚為同一分支,說明鼠曲草與三者的親緣關(guān)系較近。

本研究測序并組裝了鼠曲草的葉綠體基因組,揭示了鼠曲草的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、密碼子偏好性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為今后鼠曲草屬植物系統(tǒng)發(fā)育分析提供理論依據(jù),為菊科的分類學(xué)研究和系統(tǒng)發(fā)育分支內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系分析提供重要參考。