肖君瑤 鐘耕瑞 王漢琴 王正艷 涂明利

結(jié)核性胸膜炎及肺癌為我國常見病,多并發(fā)胸腔積液,早期診斷較困難。原癌基因蛋白質(zhì)c-Pim-1(Pim-1)是一種原癌基因, 已證實與多種腫瘤表達相關(guān)[1]。近年有研究顯示Pim-1與多種炎性疾病相關(guān)[2-4]。 Pim-1激酶對結(jié)核免疫中的淋巴及巨噬細胞等均有調(diào)控作用[5-6]。抑制Pim-1表達可抑制NF-κB p65的表達并阻斷炎癥啟動[3,7]。前期研究顯示結(jié)核性胸水中Pim-1的表達高于癌性,胸水Pim-1有利于良惡性胸水的鑒別[8]。但二者胸水Pim-1的差異性表達尚不能確定來源,且缺乏組織學證據(jù)及相關(guān)蛋白水平定量研究。本文通過免疫組化及Western-Blot方法分析了21例結(jié)核性胸膜炎,20例肺癌胸膜組織中Pim-1蛋白的分布及表達水平,并探討了與Pim-1表達相關(guān)的臨床因素,為驗證Pim-1的鑒別價值,尋找結(jié)核性胸膜炎及肺癌的病因?qū)W診斷指標及治療靶點打下基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2021年1月-2021年11月內(nèi)科胸腔鏡手術(shù)切除的確診結(jié)核性胸膜炎及肺癌的胸膜活檢標本共41例,其中男性28例,占68.3%(28/41),女性13例,占31.7%(13/41),年齡19～85歲,平均年齡(56.5±2.4)歲,兩組一般臨床資料無明顯差別(P>0.05)。所有病例均經(jīng)組織病理學證實并有完整的病理學資料,術(shù)前均未接受任何抗結(jié)核治療及放化療。其中結(jié)核性胸膜炎組21例(51.2%);肺癌組20例(48.8%),包括腺癌16例(39.0%),鱗癌3例(7.3%)和小細胞肺癌1例(2.5%)。根據(jù)UICC2009版的肺癌TNM分期進行病例分期均為Ⅳ期,其中根據(jù)影像學檢查提示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例(70.0%),無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例(30.0%),腫瘤直徑≤3cm有13例(65.0%),腫瘤直徑>3cm有7例(35.0%)。胸腔鏡下胸膜活檢組織標本分為2份,一份在-80℃冰箱凍存用于Western-Blot檢驗;一份用4%多聚甲醛通用型組織固定液,并常規(guī)石蠟包埋,切片厚4 μm,用于免疫組化染色。本研究獲得院倫理會批準(醫(yī)科倫審 2021第01號)。

二、方法

1 主要試劑

兔抗Pim-1單克隆抗體購于美國Novus Biologicals公司;兔IgG免疫組化SABC即用型試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司;GAPDH購于美國Proterintech公司。

2 免疫組織化學染色

將4 μm石蠟切片常規(guī)進行脫蠟、乙醇脫水,3%過氧化氫孵育10min,PBS熱抗原修復,5%BSA封閉后磕掉,一抗兔抗Pim-1單克隆抗體稀釋度為1:100,各步間均以PBS替代一抗為陰性對照,37℃孵育1h,PBS沖洗,加二抗37℃孵育30min,沖洗后加SABC,37℃孵育30min,DAB顯色劑顯色,顯微鏡下判斷染色程度,蘇木素復染,中性樹脂封固。

3 免疫組化結(jié)果判定

隨機選5個高倍鏡視野,計數(shù)100個細胞。先按染色強度打分:0分為無色,1分為淺黃色,2分為黃色,3分為棕黃色或棕褐色,染色強度與背景著色進行對比。再按表達陽性細胞的百分比打分:0分為陰性,1分為陽性細胞≤10%,2分為11%～50%,3分為51%～75%,4分為>75%。兩者積分相乘≤1分記為陰性;積分相乘>1分為陽性,其中2～4分為弱陽性,5～8分為中等陽性,強陽性為9～12分,陽性率(%)=[1-(陰性例數(shù)/總例數(shù))]×100%。

4 Western-Blot法檢測Pim-1蛋白表達水平

取凍存的胸膜組織,液氮凍融,每孔加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白,檢測蛋白濃度后加入緩沖液定量,取10 μg蛋白。根據(jù)常規(guī)方法進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并進行轉(zhuǎn)膜,使用5% BSA封閉1 h,一抗4℃孵育過夜(一抗稀釋比均為1:1000),TBST洗滌后二抗室溫孵育2 h,再次洗滌后使用化學發(fā)光法檢測目的條帶并使用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、Pim-1表達的形態(tài)學特點

顯微鏡下可見陽性染色為淡黃色,棕黃色,棕褐色,染色程度不等。Pim-1表達在細胞的細胞核和細胞質(zhì)中,呈彌漫性分布,以微血管周圍分布較為密集。結(jié)核性胸膜炎胸膜組織陽性染色及陰性對照(見圖1),圖1A由上往下箭頭標注處分別為陰性染色、棕褐色、棕黃色及淡黃色;肺癌胸膜組織陽性染色及陰性對照(見圖2),(圖2A)由上往下箭頭標注處分別為淡黃色及陰性染色。

圖1 結(jié)核組胸膜組織Pim-1蛋白表達(免疫組化,×200)注:A:陽性表達 B:陰性對照

圖2 肺癌組胸膜組織Pim-1蛋白表達(免疫組化,×200)注:A:陽性表達 B:陰性對照

二、Pim-1在結(jié)核性胸膜炎及肺癌組中的表達情況

在21例結(jié)核性胸膜炎組中,Pim-1強陽性表達的有7例,中等陽性6例,弱陽性7例,陰性1例,陽性率為95.24%,95%CI(0.762～0.999);在20例肺癌組中,Pim-1中等陽性2例,弱陽性12例,陰性6例,陽性率為70.00%,95%CI(0.457～0.881)。兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(見表1)。

表1 Pim-1在結(jié)核性胸膜炎(結(jié)核組)和肺癌組織的表達情況[n(%)]

三、Pim-1表達與臨床指標的關(guān)系

肺癌組中,Pim-1的表達與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性,而與性別、吸煙史、BMI、腫瘤大小及病理分型無明顯相關(guān)性。結(jié)核組中,Pim-1的表達與性別、吸煙史及BMI水平無明顯相關(guān)性。詳(見表2和表3)。

表2 肺癌組Pim-1的表達與各項臨床指標的關(guān)系[n(%)]

表3 結(jié)核組Pim-1的表達與各項臨床指標的關(guān)系[n(%)]

四、Western-Blot法檢測結(jié)核性胸膜炎及肺癌組Pim-1蛋白表達水平

Western Blot結(jié)果顯示,相較于肺癌患者,Pim-1蛋白在結(jié)核性胸膜炎患者的肺組織中表達水平較高,t=4.457,P<0.01 ) ,差異具有統(tǒng)計學意義(詳見圖3和圖4)。

圖3 Western Blot檢測肺癌組及結(jié)核組Pim-1表達水平

圖4 肺癌組及結(jié)核組Pim-1表達水平差異注:**與肺癌組相比,P<0.01

討 論

近年來傳染病的防治在我國尤為重視,且我國肺結(jié)核疫情依舊嚴峻,為全世界結(jié)核高負擔國家之一,2018年新發(fā)結(jié)核82.3萬例[9]。結(jié)核性胸膜炎是臨床上常見的結(jié)核類型,發(fā)病數(shù)量有明顯上升趨勢,國內(nèi)報道住院患者中3.5%為結(jié)核性胸膜炎[10]。肺癌又是我國常見的高發(fā)癌癥,據(jù)統(tǒng)計,癌癥死亡的最常見原因是肺癌,全球每年約179萬人死于肺癌[11],當肺癌被發(fā)現(xiàn)時絕大部分已經(jīng)有轉(zhuǎn)移[12],所以尋找病因?qū)W診斷指標及可能存在的治療靶點對早診早治顯得極為重要。

Pim-1最早作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點被發(fā)現(xiàn),分布廣泛,44Ku Pim-1主要存在于細胞膜,34Ku Pim-1在細胞質(zhì)和細胞核中都有發(fā)現(xiàn)[13],其編碼產(chǎn)物是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,實驗發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤等惡性腫瘤疾病中均有高表達[14-15]。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)Pim-1基因的T-C-T-C單元型可以使肺癌的發(fā)病率增高。有研究顯示肺癌組織中Pim-1的表達要高于正常組織,且染色強度與腫瘤疾病的發(fā)展有關(guān)[17]。同時Pim-1通過各種通路在炎性疾病中也發(fā)揮著調(diào)控作用,許多慢性炎癥相關(guān)疾病被證實有Pim-1的參與,Vries等[18]發(fā)現(xiàn),Pim-1激酶有抗過敏性哮喘的作用,Shen等[3]研究發(fā)現(xiàn)Pim-1激酶參與了黏膜損傷炎癥反應,可能成為治療炎性腸病的一種新靶點。使用SiRNA及抑制劑阻斷NF-κB信號可以抑制Pim-1蛋白的表達及抑制蛋白活性[19]。Pim-1可以使p65 Ser276位點磷酸化,敲除Pim-1可以抑制NF-κB降低炎性因子合成,阻斷炎癥啟動的惡性循環(huán)[7]。結(jié)核感染過程中通過各種信號通路來調(diào)控機體免疫應答,其中Morris等[20]發(fā)現(xiàn)炎性因子刺激小鼠的巨噬細胞,NF-κB通路被激活釋放NO和誘導型NO合酶促進機體對結(jié)核分枝桿菌的清除。但目前對Pim-1與結(jié)核病的相關(guān)研究較少,前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸腔積液中Pim-1的表達高于癌性胸水,對良惡性胸水有鑒別意義,提示Pim-1可能成為一種新的診斷指標[8]。因此對胸水中Pim-1的可能來源,Pim-1在結(jié)核性胸膜炎及肺癌胸膜組織中表達情況及蛋白水平差異的進一步探索研究顯得頗為重要。

本實驗結(jié)果表明,Pim-1在結(jié)核性胸膜炎胸膜組織的蛋白表達要高于肺癌胸膜組織,結(jié)核性胸膜炎組中Pim-1陽性率為95.24%,肺癌組中Pim-1陽性率為70.00%,差異有統(tǒng)計學意義,且Western-Blot法檢測結(jié)核性胸膜炎組Pim-1蛋白表達水平也高于肺癌組,因此猜想結(jié)核性胸膜炎胸腔積液中Pim-1的高表達,可能與結(jié)核性胸膜炎中結(jié)核感染過程中的多種炎性因子刺激胸膜組織上Pim-1高表達相關(guān)。在胸膜組織高表達Pim-1的基礎(chǔ)上,胸膜炎癥及毛細血管濾過性增加從而導致胸腔積液中Pim-1的表達增高,但這些有待于進一步完善研究證實。Pim-1有調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等重要作用,同時也參與炎性疾病的免疫過程。本實驗結(jié)果進一步驗證了結(jié)核性胸膜炎患者胸水和胸膜組織中Pim-1檢測的價值,并探索了結(jié)核性胸水中高表達的Pim-1可能來源,Pim-1很有可能成為結(jié)核性胸膜炎與肺癌的一種新的病因?qū)W診斷指標,甚至是未來治療的靶點,且兩者相較胸水Pim-1檢測更方便快捷,對患者創(chuàng)傷更小,臨床應用更有優(yōu)勢。而兩組間Pim-1的表達與臨床因素的探討,后續(xù)可納入更多、更全面的指標進行補充。Pim-1與炎性疾病相關(guān)探討日漸豐富,Pim-1與結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病機制的關(guān)系也值得我們進一步探索。