徐克耐，唐海，楊潔

（江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，天津 300410）

苯磺酸氯吡格雷是由韓國(guó)公司Hanmi Fine Chemical Co.,Ltd.開發(fā)的，用于治療腦梗塞、心肌梗死等動(dòng)靜脈血栓、以及血小板聚集相關(guān)的疾病[1]。原研未在中國(guó)上市，且該品種已被歐洲藥典收錄。有文獻(xiàn)報(bào)道了苯磺酸氯吡格雷中有關(guān)物質(zhì)研究的研究情況。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道苯磺酸氯吡格雷中溶劑殘留的研究情況。

結(jié)合本產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝情況，按照中國(guó)藥典相關(guān)通則和ICH 指導(dǎo)原則的要求，并參考與氯吡格雷相關(guān)的溶劑殘留文獻(xiàn)[2-6]，建立一套合適的分析方法，用于控制本品的質(zhì)量。

1 儀器

氣相色譜儀 AgiLent 7890B 配有7697A 頂空進(jìn)樣器（安捷倫公司），DB-624（60 m×0.53 mm×3.0 μm，安捷倫公司），電子天平（梅特勒）。

2 試劑與試藥

二甲基亞砜（DMSO，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心，批號(hào)R141080，色譜純），正丙醇（天津市元立化工有限公司，分析純），二氯甲烷（天津市元立化工有限公司，分析純），甲醇（德國(guó)Merck，批號(hào)I844007630，色譜純），異丙醇（天津市元立化工有限公司，分析純）、正庚烷（天津市化學(xué)試劑二廠，批號(hào)060215，色譜標(biāo)準(zhǔn)物）、丙酮（天津市化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130313，分析純）和乙酸乙酯（北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心，批號(hào)77998，色譜純）。

內(nèi)標(biāo)：正丙醇（阿拉丁，分析標(biāo)準(zhǔn)品）

水：娃哈哈純凈水

苯磺酸氯吡格雷（自制，20201011，20201015，20201110）

3 方法

3.1 溶液配制

稀釋劑：

二甲基亞砜：水=90∶10

對(duì)照溶液配制：

對(duì)照貯備液：取甲醇0.15 g、二氯甲烷0.06 g、異丙醇0.25 g、丙酮0.25 g、乙酸乙酯0.25 g、正庚烷0.25 g，精密稱定，加空白稀釋液定容至100 mL

內(nèi)標(biāo)貯備液：取正丙醇0.5 g 精密稱定，加空白稀釋液定容至100 mL

對(duì)照溶液：取1 mL 內(nèi)標(biāo)貯備液+1 mL 對(duì)照貯備液加空白稀釋液定容至10 mL，制成每1 mL 中分別含甲醇0.15 mg、二氯甲烷0.03 mg、異丙醇0.25 mg、正庚烷0.25 mg、丙酮0.25 mg 的混合對(duì)照溶液。

樣品溶液配制：

取本品約0.5 g，精密稱定，加1 mL 內(nèi)標(biāo)貯備空白稀釋液溶解并定容至10 mL，作為供試品溶液；分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液2 mL 置于20 mL 頂空瓶中，密封。

3.2 色譜條件

3.2.1 頂空進(jìn)樣器

平衡溫度為 80 ℃，平衡時(shí)間為30 分鐘，分流比為5∶1，載氣流速為4 mL/min

3.2.2 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度：200 ℃；

檢測(cè)器溫度：250 ℃；

柱溫：程序升溫，升溫如下：起始溫度40 ℃，維持12 分鐘，再以每分鐘20 ℃的速率升溫至60 ℃，維持12 分鐘，再以每分鐘40 ℃的速率升溫至220 ℃，維持5 分鐘。在上述條件下，取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1），各有機(jī)溶劑色譜峰分離完全。

圖1 苯磺酸氯吡格雷溶劑殘留—專屬性—混標(biāo)Fig.1 Residual organic solvents in clopidogrel besilate-specificity-mixtured standard

4 結(jié)果

4.1 線性及范圍

精密量取對(duì)照品貯備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 分別置于10 mL 量瓶中，各精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加90%二甲基亞砜水溶液稀釋至刻度，搖勻。分別取1 μL 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，分別以甲醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正庚烷對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（A），甲醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正庚烷濃度為橫坐標(biāo)（C），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性及范圍見表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品在濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，能滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

4.2 檢測(cè)限、定量限

取線性測(cè)試項(xiàng)下的溶液逐步稀釋，進(jìn)樣，測(cè)得結(jié)果見表2。

表2 檢測(cè)限和定量限Tab.2 Limit of detection and quantification

試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)限和定量限的信噪比符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.3 回收率

分別取本品約0.5 g，精密稱定，置于10 mL 量瓶中（共10 份），精密加入貯備液0.8 mL（3 份）、1.0 mL（3 份）、1.2 mL（3 份），另取一份不加貯備液，作為空白對(duì)照，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加90%DMSO 水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻（共10 份），精密量取2 mL 置于20 mL 頂空瓶中，密封。注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；另取對(duì)照品溶液同法測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 甲醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正庚烷的回收率試驗(yàn)Tab.3 Recovery of methanol,acetone,isopropyl alcohol,dichloromethane,ethyl acetate and n-heptane

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率數(shù)據(jù)符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.4 重現(xiàn)性

取對(duì)照品溶液按擬定殘留溶劑測(cè)定法操作，重復(fù)進(jìn)樣6 次，分別取本品約0.5 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，精密加入貯備液1.0 mL（6 份）再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加90%DMSO 水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL 置于20 mL 頂空瓶中，密封。注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；另取對(duì)照品溶液同法測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 叔丁基甲基醚、丙酮、四氫呋喃、甲醇、二氯甲烷、甲苯、吡啶、環(huán)己酮、乙酸的重現(xiàn)性試驗(yàn)（n=6）Tab.4 Reproducibility of tert-butyl methyl ether,acetone,tetrahydrofuran,methanol,dichloromethane,toluene,pyridine,cyclohexanone and acetic acid（n=6）

重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果表明，重現(xiàn)性數(shù)據(jù)符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.5 中間精密度

按擬定殘留溶劑檢測(cè)方法，不同時(shí)間、不同檢測(cè)人員在不同儀器上，對(duì)同一批樣品進(jìn)行精密度測(cè)定，兩次測(cè)試的溶劑殘留結(jié)果見表5。

表5 樣品測(cè)定中間精密度Tab.5 Intermediate precision results of samples

測(cè)試一：GC1#氣相、安捷倫FID 檢測(cè)器測(cè)試二：GC2#氣相、安捷倫FID 檢測(cè)器

結(jié)論：擬定的殘留溶劑檢測(cè)方法中間精密度良好。數(shù)據(jù)符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.6 溶液穩(wěn)定性

供試品溶液在室溫保存24 小時(shí)后測(cè)定，結(jié)果與原測(cè)結(jié)果基本一致，見表6。

表6 溶液穩(wěn)定性結(jié)果比較Tab.6 Comparison of solution stability

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在24h 內(nèi)始終保持穩(wěn)定，沒有生成其他雜質(zhì)，符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.7 耐用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照溶液、供試品溶液，各20 μL 進(jìn)樣，分別在頂空平衡溫度、進(jìn)樣口溫度、檢測(cè)器溫度、柱溫和流速波動(dòng)的色譜條件下測(cè)定，考察系統(tǒng)適用性以及藥物含量的變化情況。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，色譜柱廠家、型號(hào)與規(guī)格確定為安捷倫DB624（60 m×0.53 mm×3 μm）。其余考察條件見表7?？疾旖Y(jié)果見表8。

表7 耐用性條件Tab.7 Condition of robustness

表8 耐用性-溶劑殘留測(cè)定結(jié)果Tab.8 Robustness-results of determination

結(jié)論：溶劑殘留測(cè)定方法耐用性良好。符合中國(guó)藥典（四部，2020 版，9101 通則）分析方法驗(yàn)證的要求，能滿足分析方法開發(fā)和樣品測(cè)定的要求。

4.8 樣品測(cè)定

供試品溶液制備方法見“3.1 溶液配制”，共檢測(cè)三批樣品，檢測(cè)結(jié)果表9。

表9 三批樣品中溶劑殘留情況（n=3）Tab.9 Results of residual organic solvents in three batches（n=3）

測(cè)定結(jié)果表明，樣品中的溶劑殘留情況符合ICH Q3C 中規(guī)定的限值，為合格產(chǎn)品。

5 討論與展望

5.1 討論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)比較了HP-1，DB-1，HP-5，DB-5，DB-WAX 和DB-624 的分離效果，試驗(yàn)結(jié)果顯示DB-624 分離效果好；通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，苯磺酸不會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果；預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只以DMSO 作為溶劑，對(duì)頂空進(jìn)樣系統(tǒng)的管路污染比較嚴(yán)重，嘗試過以DMF為溶劑，也會(huì)嚴(yán)重污染管路，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確定DMSO-水作為混合溶劑，沒有出現(xiàn)管路污染的現(xiàn)象。

5.2 展望

后續(xù)還將深入研究苯磺酸氯吡格雷的有關(guān)物質(zhì)、致突變雜質(zhì)等，爭(zhēng)取盡早把該產(chǎn)品推向市場(chǎng)，讓患者早日享受到物美價(jià)廉的仿制藥。該產(chǎn)品盡早上市，在給患者帶來健康的同時(shí)，也會(huì)減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。