張競(jìng)，周志艷，李丹丹，安麗康，王巖勃，鄒衛(wèi)

1.河北冀兆聯(lián)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050051；2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050200；3.石家莊沃泰生物科技有限公司，河北 石家莊 050018；4.河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018

重組人腦利鈉肽是一種通過(guò)重組DNA 技術(shù)合成的、相對(duì)分子質(zhì)量為3 464 的多肽，與心室肌產(chǎn)生的內(nèi)源性多肽有相同的序列和空間結(jié)構(gòu)，因此有相同的生物活性［1］。研究表明，補(bǔ)充幾倍甚至十幾倍的外源性腦利鈉肽時(shí)，能迅速有效治療心力衰竭，改善預(yù)后［2-3］。目前，國(guó)內(nèi)外由腦利鈉肽開(kāi)發(fā)的新型藥物均已上市。但在該藥物質(zhì)量研究過(guò)程中，等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）的檢測(cè)一直是技術(shù)瓶頸。重組人腦利鈉肽pI 為10.9，超出了常規(guī)測(cè)定方法的pI 范圍，不論采用凝膠電泳還是毛細(xì)管電泳，檢測(cè)結(jié)果均不理想［4-6］。

1992年發(fā)展起來(lái)的新一代全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection，CIEF-WCID）是一種將毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）和全柱成像檢測(cè)結(jié)合起來(lái)的技術(shù)［7-16］。其中CIEF 將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細(xì)管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH 梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自的pI 時(shí)變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶［17］，當(dāng)樣品進(jìn)行等電聚焦檢測(cè)時(shí)，互補(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體（compIementary metal-oxide-semicondu-ctor translator，CMOS）作為成像檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)整個(gè)聚焦分離通道、聚焦過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和記錄，該過(guò)程中不移動(dòng)毛細(xì)管柱，也無(wú)須移動(dòng)樣品［18］。因此可大幅度縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度。

本研究采用CIEF-WCID 法對(duì)兩性電解質(zhì)、占位劑、蛋白濃度、聚焦條件等進(jìn)行優(yōu)化［19-23］，獲得檢測(cè)重組人腦利鈉肽pI 的最佳條件，并對(duì)建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證［24-25］及初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重組人腦利鈉肽理化對(duì)照品（批號(hào)：20130601）及3批樣品（批號(hào)：20161001、2016-1002、20161101）購(gòu)自石家莊沃泰生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；精氨酸（分析純）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；毛細(xì)管分離柱、全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳儀CE Infinite、兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5 和9-11、陽(yáng)極電解液、陰極電解液、pI標(biāo)記物、1%甲基纖維素溶液購(gòu)自加拿大AES公司。

1.2 方法建立

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 兩性電解質(zhì)選擇 加入35 μL理化對(duì)照品和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI 標(biāo)記物10.10 和10.45，8 μL兩性電解質(zhì)（HR AESlyte 8-10.5或9-11），超純水補(bǔ)齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.1.2 占位劑選擇 加入35 μL理化對(duì)照品和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI標(biāo)記物10.10和10.45，8 μL 兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5，不同濃度占位劑（15、20、25 mmol／L氫氧化鈉或5、10、20 mmol／L精氨酸），超純水補(bǔ)齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.1.3 蛋白濃度的選擇 加入不同體積（2.4、4.5、9.0、17.5 μL）理化對(duì)照品（使重組人腦利鈉肽終濃度分別為12、22.5、45 和87.5 μg／mL）和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI標(biāo)記物10.10和10.45，8 μL兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5，占位劑25 mmol／L氫氧化鈉，超純水補(bǔ)齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.2 CIEF-WCID 條件 在樣品制備條件優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進(jìn)行聚焦條件的摸索。采用自動(dòng)進(jìn)樣方式，每次進(jìn)樣前用50 μL 0.2%甲基纖維素沖洗毛細(xì)管；聚焦電壓和時(shí)間：第1次聚焦1 000 V 1 min、第2 次聚焦2 000 V 1 min、第3 次聚焦3 000 V 分別6、8、10 min；圖像采集間隔設(shè)置為20 s；樣品池溫度設(shè)置為8 ℃。

1.3 方法驗(yàn)證

1.3.1 重復(fù)性 按照1.2項(xiàng)優(yōu)化后的方法制備1份樣品進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.2 樣品間精密度 按照1.2項(xiàng)優(yōu)化后的方法制備6份樣品，分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算RSD。

1.3.3 耐用性 按照1.2 項(xiàng)優(yōu)化后的方法制備樣品，調(diào)整蛋白濃度分別為50、87.5 和125 μg／mL，分別進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算RSD。

選擇3 組pI 標(biāo)記物（9.46／9.77、9.77／10.10和10.10／10.45），按照1.2項(xiàng)優(yōu)化后方法制備樣品，進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次，計(jì)算RSD；按照1.2 項(xiàng)優(yōu)化后的方法制備樣品，分別于0、1、3、5 h 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算RSD。

1.4 方法的初步應(yīng)用 取連續(xù)生產(chǎn)的3 批重組人腦利鈉肽，按照1.2 項(xiàng)優(yōu)化后的方法進(jìn)行樣品制備及檢測(cè)，考察結(jié)果一致性。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用CEInsight 軟件采集數(shù)據(jù)，Clarity軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 方法的建立

2.1.1 兩性電解質(zhì)選擇 用HR AESlyte 8-10.5 可正常檢測(cè)出1 個(gè)pI 標(biāo)記物，其余樣品未檢出；用HR AESlyte 9-11 獲得的的圖譜基線波動(dòng)大，無(wú)法正常檢測(cè)出重組人腦利鈉肽的pI。見(jiàn)圖1。推測(cè)HR AESlyte 8-10.5與待測(cè)樣品pI不同，使樣品易跑出毛細(xì)管柱，因此選擇HR AESlyte 8-10.5 作為兩性電解質(zhì)，后續(xù)加入占位劑繼續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5（A）和HR AESlyte 9-11（B）的CIEF-WCID圖譜Fig.1 CIEF-WCID profile of different amphoteric electrolytes HR AESlyte 8-10.5（A）and HR AESlyte 9-11（B）

2.1.2 占位劑選擇 加入精氨酸后，待測(cè)樣品峰被遮擋，依然僅有2 個(gè)pI 標(biāo)記物的峰，不能檢出待測(cè)樣品峰；加入氫氧化鈉后，重組人腦利鈉肽峰可聚焦檢測(cè)到，并且隨著氫氧化鈉濃度的升高，其離右側(cè)邊界越遠(yuǎn)。見(jiàn)圖2。為了檢測(cè)的穩(wěn)定性，選擇25 mmol／L氫氧化鈉作為占位劑。

圖2 不同占位劑樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.2 CIEF-WCID profile of different space-occupying agent samples

2.1.3 蛋白濃度選擇 確定占位劑和兩性電解質(zhì)后，選擇的4種蛋白終濃度（87.5、45、22.5和12 μg／mL）建立的檢測(cè)方法均具有較好的靈敏度和重復(fù)性，但隨著蛋白濃度的降低，電泳圖會(huì)向右發(fā)生偏移，見(jiàn)圖3。因此選擇最大適宜濃度87.5 μg／mL 作為樣品終濃度。

圖3 不同蛋白濃度樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.3 CIEF-WCID profile of samples with different protein concentrations

2.1.4 聚焦條件 3 種聚焦時(shí)間各峰峰形均無(wú)變化，在第3 次聚焦6 min 時(shí)已完成檢測(cè)，見(jiàn)圖4。確定聚焦條件為：1 000 V 1 min→2 000 V 1 min→3 000 V 6 min。

圖4 不同聚焦時(shí)間下樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.4 CIEF-WCID profile of samples under different focu sing times

最終確定檢測(cè)重組人腦利鈉肽CIEF-WCID法的條件為：兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5、占位劑25 mmol／L氫氧化鈉、樣品濃度87.5 μg／mL、聚焦電壓及時(shí)間：1 000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 重復(fù)性 同一樣品6 次檢測(cè)pI 分別為10.86、10.87、10.87、10.86、10.87和10.85，平均值為10.86，RSD為0.1%；等電聚焦電泳圖峰形均無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖5。表明方法重復(fù)性良好，可滿足試驗(yàn)要求。

圖5 重復(fù)性驗(yàn)證的CIEF-WCID圖譜Fig.5 CIEF-WCID profile for verification of repeatability

2.2.2 樣品間精密度 6份樣品pI分別為10.85、10.86、10.85、10.86、10.86、10.86，平均值為10.86，RSD為0.1%。等電聚焦電泳圖峰形均無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖6。表明方法精密度良好，可用于重組人腦利鈉肽的檢測(cè)。

圖6 精密度驗(yàn)證的CIEF-WCID圖譜Fig.6 CIEF-WCID profile for verification of precision

2.2.3 耐用性

2.2.3.1 對(duì)蛋白濃度的耐用性3種濃度下檢測(cè)pI的RSD為0.1%，見(jiàn)表1；等電聚焦電泳圖峰形均無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖7，耐用性良好。

圖7 樣品濃度耐用性驗(yàn)證的CIEF-WCID圖譜Fig.7 CIEF-WCID profile for verification of durability of sample concentration

表1 樣品濃度耐用性的驗(yàn)證結(jié)果（pI）Tab.1 Verification for durability of sample concentration（pI）

2.2.3.2 對(duì)pI標(biāo)記物的耐用性 9.46／9.77和9.77／10.10 的pI 標(biāo)記物組合均不能檢測(cè)出重組人腦利鈉肽的pI，僅能應(yīng)用10.10／10.45 的pI 標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)圖8。

圖8 pI標(biāo)記物耐用性驗(yàn)證的CIEF-WCID圖譜Fig.8 CIEF-WCID profile for verification of durability of pI marker

2.2.3.3 對(duì)樣品進(jìn)樣時(shí)間的耐用性 0、1、3、5 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)pI分別為10.87、10.87、10.87、10.86，平均值為10.87，RSD為0.1%；等電聚焦電泳圖峰形均無(wú)明顯變化，圖9。耐用性良好。

圖9 進(jìn)樣時(shí)間的耐用性驗(yàn)證CIEF-WCID圖譜Fig.9 CIEF-WCID profile for verification of durability of injection time

綜上所述，建立的方法對(duì)蛋白濃度、樣品進(jìn)樣時(shí)間耐用性良好，但pI標(biāo)記物不可隨意更換。

2.3 方法的初步應(yīng)用 3 批樣品等電聚焦電泳圖譜一致，與理論pI結(jié)果一致，可用于重組人腦利鈉肽pI的檢測(cè)，見(jiàn)圖10。

圖10 重組人腦利鈉肽樣品pI檢測(cè)的CIEF-WCID圖譜Fig.10 CIEF-WCID profile of pI detection of recombinant human brain natriuretic peptide samples

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)兩性電解質(zhì)、占位劑、蛋白濃度以及聚焦時(shí)間等條件的摸索，獲得了CIEF-WCID 法的主要參數(shù)及檢測(cè)條件后，用于重組人腦利鈉肽pI 的分析。

在CIEF技術(shù)中，兩性電解質(zhì)通常用于產(chǎn)生pH梯度。當(dāng)在混有兩性電解質(zhì)的樣品上施加電壓時(shí)，pI最低的兩性電解質(zhì)（負(fù)電荷最多）向陽(yáng)極移動(dòng)，pI 最高的兩性電解質(zhì)（正電荷最多）向陰極移動(dòng)。其他兩性電解質(zhì)會(huì)根據(jù)它們的pI值將溶液緩沖至相應(yīng)的pH，而這個(gè)結(jié)果會(huì)是一個(gè)連續(xù)的pH范圍。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的成功分離，根據(jù)pH 范圍和強(qiáng)度選擇的兩性電解質(zhì)是重要參數(shù)之一。由于重組人腦利鈉肽pI為10.9，呈極堿性，現(xiàn)有pI標(biāo)記物不能將其包含進(jìn)去，因此選則離該pI 最近的1 組pI 標(biāo)記物10.10、10.46。為達(dá)到樣品與pI 標(biāo)記物最好的分離效果，選擇不同范圍的兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5 和9-11 進(jìn)行優(yōu)化，最終確定將HR AESlyte 8-10.5作為兩性電解質(zhì)。

由于整根毛細(xì)管充滿了兩性電解質(zhì)和樣品溶液，因此聚焦在毛細(xì)管出口端的極堿性蛋白質(zhì)在遷移過(guò)程中無(wú)法被檢測(cè)到。需要在樣品加入占位劑，用于占據(jù)毛細(xì)管出口端的位置，避免發(fā)生極堿性蛋白聚集在檢測(cè)窗口之后的現(xiàn)象。本研究選擇精氨酸和氫氧化鈉作為占位劑，其中精氨酸選擇5、10、20 mmol／L 3 個(gè)濃度，NaOH 選擇15、20、25 mmol／L 3 個(gè)濃度，進(jìn)行篩選。最終確定加入25 mmol／L 氫氧化鈉作為占位劑。

在相同的樣品體系和聚焦條件下，蛋白質(zhì)溶解度也不相同。當(dāng)?shù)鞍诐舛冗^(guò)高時(shí)，溶解度低的蛋白會(huì)沉淀，從而導(dǎo)致電泳圖峰型變差，重現(xiàn)性降低；溶解度高的蛋白也會(huì)因樣品過(guò)載而導(dǎo)致分辨率下降。但另一方面，蛋白濃度也不能過(guò)低，才可達(dá)到足夠的檢測(cè)靈敏度。經(jīng)試驗(yàn)，確定87.5 μg／mL 作為樣品終濃度。在樣品配制條件優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進(jìn)行了聚焦條件的摸索，最終確定擇1000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min為聚焦條件。

為確認(rèn)建立的方法適用于相應(yīng)檢測(cè)要求，本研究進(jìn)行了方法驗(yàn)證。重復(fù)性可測(cè)定同一份均勻供試品經(jīng)多次測(cè)定所得結(jié)果間的接近程度［17］。耐用性是指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)［17］。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，應(yīng)考慮其耐用性，本實(shí)驗(yàn)選取了蛋白濃度、pI標(biāo)記物和樣品進(jìn)樣時(shí)間3個(gè)影響因素進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果顯示，該方法重復(fù)性好、精密度高。

由于重組人腦利鈉肽的pI 過(guò)高，導(dǎo)致其分析方法存在不穩(wěn)定性。而本研究建立的CIEF-WCID法經(jīng)驗(yàn)證后，可準(zhǔn)確、穩(wěn)定地進(jìn)行pI檢測(cè)。為進(jìn)一步確認(rèn)該方法的可靠性，選擇連續(xù)生產(chǎn)的3 批重組人腦利鈉肽進(jìn)行檢測(cè)，均可穩(wěn)定檢測(cè)pI，表明建立的方法可用于重組人腦利鈉肽pI 檢測(cè)，為后續(xù)重組人腦利鈉肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考。

綜上所述，本研究建立的CIEF-WCID法可穩(wěn)定、準(zhǔn)確地檢測(cè)出腦利鈉肽這一極堿性多肽的pI，也證明了該方法可測(cè)定極端pI 多肽，對(duì)于生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義。