胡亞琪 高磊 郝萬山 姜敏**

(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,北京 100078)

GLOBOCAN2020癌癥報告[1]表明:2020年全球肺癌以死亡率達18%位居榜首,肺癌的發(fā)病率為11.4%。據(jù)GLOBOCAN2020報告數(shù)據(jù),中國肺癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別占全球的37.0%和39.8%[2]。肺癌根據(jù)組織病理學可分為非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小細胞肺癌,其中非小細胞肺癌發(fā)病率占肺癌中的85%～90%[3],大多數(shù)非小細胞肺癌患者確診時已處疾病晚期,失去手術機會?，F(xiàn)代醫(yī)學對非小細胞肺癌患者治療手段有分子靶向藥及免疫檢查點抑制劑等,取得了一定療效,但依然存在驅動基因敏感陰性、靶向藥治療耐藥[4]、免疫檢查點抑制劑不良反應[5]等問題。而中醫(yī)藥在抑制腫瘤增長與轉移、降低腫瘤負荷及調節(jié)患者免疫功能等方面有其特色[6],對提高患者生存質量、改善預后有重要的作用。

中醫(yī)認為非小細胞肺癌作為肺癌的一種類型,其核心病機仍然不離虛與痰[7-8],扶正與化痰散結為重要治法[9]。黃芪作為重要的補肺益氣中藥,《神農本草經》[10]言其治“久敗瘡,排膿止痛,大風癩疾……補虛”;半夏是化痰散結、止咳降逆的代表藥,陶弘景《本草經集注》[11]言其“消心腹胸中膈痰熱滿結,咳嗽上氣”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),黃芪中的黃芪多糖、黃芪甲苷均有抗腫瘤作用[12-13],半夏多糖也同樣具有抗腫瘤作用[14]。眾多研究表明,黃芪聯(lián)合其它中藥有良好的協(xié)同抗腫瘤作用[15-19],但是目前尚未見到“黃芪-半夏”藥對聯(lián)合治療腫瘤機制的研究。網絡藥理學基于高通量組學數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及網絡數(shù)據(jù)庫檢索基礎上[20],針對中藥成分復雜、多靶點、多途徑的特點提供了一種科學的研究方法。本研究利用網絡藥理學與分子對接技術,探討“黃芪-半夏”藥對的主要核心靶點及與NSCLC之間的相互關系,為臨床應用及進一步的基礎研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1“黃芪-半夏”藥對活性成分收集與靶點篩選 分別以“黃芪”與“半夏”為檢索詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫[21](網址:http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)進行搜索,篩選出“黃芪”與“半夏”的有效成分與作用靶點,其中設置口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18為條件[22-23]。并結合相關文獻篩選有效成分及作用靶點,分別將兩個藥物各自的作用靶點去重整合,運用Uniprot數(shù)據(jù)庫[24]對靶點校正為標準基因名稱。

1.2NSCLC疾病靶點及交集靶點獲取 在GeneCards[25]、PharmGKB[26]、DrugBank[27]、OMIM[28]數(shù)據(jù)庫中,以“Non-Small Cell Lung Cancer”為檢索詞條,搜索NSCLC疾病靶點,運用在線Venny工具(網址:https://bioinfogp.cnb.csic.es)將四個疾病數(shù)據(jù)庫所獲得的靶點取并集,即為非小細胞肺癌的總疾病靶點,接著將總疾病靶點和整合的“黃芪-半夏”藥對取交集,即為“黃芪-半夏”藥對治療非小細胞肺癌的有效作用靶點。

1.3構建并分析“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖 將完成整合的“黃芪-半夏”藥對與非小細胞肺癌的共同靶點導入Cytoscape軟件[29],構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡,以藥物、成分、靶點、疾病作為網絡中的“節(jié)點”,“節(jié)點”之間相互連接的線段為“邊”,運用Cytoscape軟件中的內置工具(Tools)中的NetworkAnalyzer對研究的網絡進行分析,并獲取分析所得結果。

1.4構建蛋白質相互作用(PPI)網絡并篩選關鍵靶點 將藥對與NSCLC共同靶點導入String V 11.0數(shù)據(jù)庫[30],設置置信度“medium confidence”(0.4)、蛋白種類為“homo sapiens”,并隱藏網絡中無關聯(lián)節(jié)點。輸出TSV格式文件后將其導入Cytoscape軟件。對網絡進行拓撲分析,設置篩選條件為:自由度(Degree)大于或等于中位數(shù),獲取關鍵靶點。

1.5GO富集分析和KEGG通路分析 利用Cytoscape軟件中Cluego插件對上述篩選出的關鍵靶點進行GO功能富集分析,選擇ClueGO:Functional Analysis,選擇使用GO Term Fusion,只展示P value≤0.05的通路。設置GO Tree區(qū)間:Min Level:3;Max Level:8;GO term:Min #Genes:7,5.0% Genes,進行可視化分析。將富集的目的基因導入在線分析平臺“微生信”(bioinformatics,網址:http://www.bioinformatics.com.cn)對關鍵基因進行KEGG分析。為進一步從信號通路角度分析“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的可能作用機制,以富集基因數(shù)>10、P<0.01作為篩選條件,并排除與腫瘤不相關的信號通路,繪制“藥物成分-靶點-通路”圖。

1.6“黃芪-半夏”藥對有效成分與關鍵靶點分子對接 從pubchem數(shù)據(jù)[31](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載篩選出的關鍵化合物的2D結構的mol2格式文件,將其導入AutoDockTools-1.5.6軟件中,添加原子電荷并分配原子類型,所有柔性鍵都改為默認可旋轉并保存為pdbqt格式作為對接配體。取上述篩選的核心靶點,于Uniprot數(shù)據(jù)庫尋找活性成分的3D構象,將查詢的PDB id輸入pdb數(shù)據(jù)庫[32](https://www.rcsb.org/)中并下載其相應蛋白的3D結構將其保存為pdb格式。將此3D結構導入AutoDockTools-1.5.6軟件中,進行去除水分子、加氫、加電荷及各項優(yōu)化,設置網格箱(gird box)為默認值,最后將優(yōu)化后的蛋白保存為pdbqt格式作為對接受體。根據(jù)靶蛋白中配體的坐標以及靶蛋白活性口袋進行相關設置,采用Auto Dock Vina 1.1.2進行分子對接,最后將結果導入PyMOL軟件中進行結果可視化。

2 結果

2.1“黃芪-半夏”藥對活性成分收集與靶點篩選結果 通過TCMSP平臺檢索后,本研究得到中藥黃芪有效成分87個,半夏有效成分116個,在OB≥30%且DL≥0.18條件下,篩選得出黃芪有效成分12個,半夏有效成分7個,編號及 ADME關鍵參數(shù)見表1。采用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢兩味中藥主要活性成分作用靶點,運用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點校正為標準基因,去重整合后得到:黃芪活性成分作用靶點211個,半夏活性成分作用靶點87個。

表1 “黃芪-半夏”藥對活性成分

2.2NSCLC靶點、交集靶點獲取及構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡 在drugbank、GeneCards、PharmGKB、OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索到55、710、144、471個非小細胞肺癌的潛在靶點,去掉127個重復靶點后,得到1253個NSCLC相關靶點,繪制疾病靶點韋恩圖,見圖1。將中藥黃芪作用靶點合并半夏作用靶點共298個,去掉72個重復靶點,得到226個“黃芪-半夏”藥對作用靶點。將藥對作用靶點與NSCLC疾病靶點取交集,得到97個共同靶點,見圖2。將“黃芪-半夏”藥對與NSCLC的共同靶點導入Cytoscape,構建黃芪-半夏藥對“中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖,見圖3。其中箭頭代表非小細胞肺癌,正六邊形代表“黃芪-半夏”藥物成分,長方形代表共同靶點。該網絡中共有節(jié)點114個、邊234條,其中度值較高的為:槲皮素、山柰酚、異鼠李素、熊竹素、黃芩素、β-谷甾醇,在此網絡中,度值≥3的靶點有39個,其中度值代表網絡中與該節(jié)點直接作用的節(jié)點數(shù)量,數(shù)值越大相互聯(lián)系越多,所以這表明“黃芪-半夏”藥對通過多種成分調控多個靶點達到抗腫瘤的作用。

圖1 NSCLC疾病靶點韋恩圖

圖2 NSCLC與“黃芪-半夏”藥對共同靶點韋恩圖

圖3 “黃芪-半夏藥對-成分-靶點-NSCLC”網絡圖

2.3蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選結果 將藥對、疾病共同作用的97個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫構建PPI網絡,見圖4,1個無關聯(lián)節(jié)點設置為隱藏,此網絡圖中共有96個節(jié)點,2021條邊,下載此網絡TSV格式文件并導入Cytoscape軟件行拓撲分析,設置篩選條件為大于等于Degree的中位數(shù),獲取“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的關鍵靶點,并繪制關鍵靶點相互作用網絡圖,見圖5。每個節(jié)點代表由一個蛋白編碼基因產生的蛋白質,蛋白間的連線表示預測的功能關聯(lián)。圖中按degree值大小設置節(jié)點大小,degree值越大,節(jié)點越大。(注:淺藍線-輔助數(shù)據(jù)庫證據(jù);紫線-實驗證明;黃線-文中挖掘證據(jù);綠線-基因相近;紅線-基因融合;藍線-基因共同產生;黑線-基因共同表達;灰線-蛋白質同源。)

圖4 PPI網絡

圖5 關鍵靶點相互作用網絡

2.4GO富集分析 運用Cytoscape軟件中Cluego插件進行GO功能富集分析,構建富集分析網絡圖,如圖6。分析得生物過程(BP)條目數(shù)466條,其中P<0.01的條目數(shù)298條。數(shù)據(jù)顯示,生物過程顯著性排名靠前的主要有:細胞因子介導的信號通路,基因表達的正向調控,RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控,DNA模板轉錄的正調控,血管生成等生物過程。

圖6 GO富集分析過程網絡圖

圖7 關鍵靶點的KEGG通路圖

2.5KEGG通路富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對對關鍵靶點進行 KEGG通路分析,共得到 146條信號通路(P<0.01),根據(jù)P值由小到大篩選排名前 20的通路繪制氣泡圖,如圖 7。

以基因數(shù)>10個為篩選條件,排除與腫瘤不相關的通路后,最后確定了12條通路分別為:Pathways in cancer信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路等。依據(jù)藥物有效成分、疾病靶點即信號通路之間的聯(lián)系,建立“藥物成分-靶點-通路”網絡圖,如圖8。在關鍵的Pathways in cancer信號通路上標注出“黃芪-半夏藥對作用位點,如圖9。

圖8 “藥物成分-靶點-通路”網絡圖

(注:紅色代表“黃芪-半夏”藥對在信號通路上的作用位點)

2.6分子對接 選擇度值排名前5的核心靶點(TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA)與“藥物成分-靶點-通路”網絡圖中排名靠前的化合物(槲皮素、山柰酚、黃芩素)進行分子對接。結合能<0 kcal/moI表示化合物與蛋白有結合能力,結合能<-5.0 kcal/mol表示化合物與蛋白結合良好,結合能<-7.5 kcal/mol表示化合物與蛋白結合能力極好。展示前 3個結合力較好的分子對接模式圖,見圖 10。

結果表明“黃芪-半夏”藥對主要活性化合物與5個核心靶點的結合能力皆良好,其中TP53靶點與槲皮素、山奈酚、黃芩素結合都極好,JUN靶點分別與山奈酚、黃芩素結合極好。

3 討論

中藥藥對指兩種或三種中藥聯(lián)合使用時產生協(xié)同治療或者特殊療效的藥物組[33]。在腫瘤的治療過程中,以辨證論治為基礎重視藥對的運用有助于提高療效[34]。朱丹溪在《丹溪心法》言:“凡人身上中下有塊者多是痰……”[35]針對肺癌患者虛實夾雜的病機特點,“黃芪-半夏”藥對益氣扶正與化痰散結同施,已為許多中醫(yī)大家運用于腫瘤的治療中[36,39]。

本研究通過中藥數(shù)據(jù)庫篩選出“黃芪-半夏”藥對有效活性成分19個,其中槲皮素、山奈酚、黃芩素可能是“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的關鍵成分。吳洪皓等[40]發(fā)現(xiàn)槲皮素能促進miR-29b表達進而抑制PI3K/Akt信號通路,產生促進肺腺癌A549細胞凋亡的效果。槲皮素還可上調miR-101進而抑制EZH2表達,通過抑制EMT進程來降低NSCLC細胞耐藥性[41]。趙存玲等[42]研究表明,槲皮素有抑制非小細胞肺癌系H3122細胞分泌EGF、HGF以及表達Snail轉錄因子的能力,進而可能夠抑制H3122細胞增殖、遷移。黃芪中的山奈酚能夠激活從細胞質到細胞核的 IRE1-JNK-CHOP 信號傳導,抑制G9a而激活胃癌細胞中的自噬性細胞死亡[43]。山奈酚作為一種較強的蛋白激酶CK2抑制劑[44],能夠抑制P-糖蛋白的功能和表達、調控環(huán)氧合酶-2的轉錄[45]。實驗表明,山奈酚通過調控miR21抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖[46]。此外,山奈酚能夠抑制雌激素相關受體α(ERRα)從而降低NSCLC A549細胞侵襲和遷移能力[47]。半夏中的黃芩素有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎活性[48],炎癥與腫瘤密切相關[49-50],研究表明,黃芩素可降低腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白-1、白細胞介素-6,進而升高肺組織中的白細胞介素-10、干擾素γ以調節(jié)炎癥反應,且能抑制肺組織中補體的過度激活、減少補體的沉積[51]。張劉蓮等發(fā)現(xiàn)黃芩素調節(jié)miR-496-SDF-1軸從而抑制子宮頸癌HCC94細胞的增殖與轉移[52]。通過下調Ezrin,Skp2蛋白的表達,黃芩素可抑制肺癌A549細胞的增殖與遷移,并能誘導細胞凋亡[53]。此外,黃芩素能抑制EMT的發(fā)生,從而增強人肺癌細胞A549/CDDP細胞株順鉑毒性[54]。本研究發(fā)現(xiàn)Pathways in cancer信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路是“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的關鍵通路,基于分子對接結果,推測槲皮素、山奈酚、黃芩素是“黃芪-半夏”藥對通過多靶點協(xié)同治療NSCLC增效的潛在藥理物質基礎。

PPI網絡拓撲分析表明,“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的關鍵靶點有48個。包括TP53、CASP3、TNF、MYC、AKT、ESR等與細胞周期調控、細胞凋亡、腫瘤血管生成相關的靶點,以及JUN、VEGFA、HIF1A、EGFR等涉及腫瘤細胞增值、分化、侵襲及轉移的靶點。其中AKT作為一種胞漿信號轉導蛋白,在腫瘤細胞的周期調控、代謝及凋亡方面有重要作用,NSCLC癌組織中的AKT1蛋白水平升高,與腫瘤進展及不良預后相關[55]。CASP3作為細胞凋亡的標記分子,其表達上調意味著腫瘤細胞處于凋亡狀態(tài)[56]。VEGFA屬于血管內皮生長因子家族中重要的影響微血管形成的細胞因子,除促進腫瘤血管形成之外,通過調節(jié)腫瘤血管變化、調節(jié)細胞黏附因子、調節(jié)免疫細胞等參與腫瘤免疫抑制[57]。雌激素通過激活ESR(雌激素受體)促進腫瘤的生長[58],研究表明,雌激素能下調miRNA-365表達進而抑制NSCLC細胞的凋亡[59],ERα高表達則NSCLC患者的總體生存期顯著降低[60]。由于腫瘤組織中普遍存在缺氧微環(huán)境,HIF1A(低氧誘導因子-1),HIF-1是癌細胞適應低氧環(huán)境的激發(fā)因子,能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移[61-63]。對于腫瘤壞死因子其高表達則可以抑制肺癌細胞增殖[64]。

KEGG富集分析結果表明,“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC的主要信號通路涉及:Pathways in cancer信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路等。本研究發(fā)現(xiàn),在Pathways in cancer信號通路中包含了TP53、CASP3、JUN、VEGFA、ESR1、HIF1A、IL6、MYC、EGFR等關鍵基因,結合Pathways in cancer信號通路圖推測,“黃芪-半夏”藥對治療NSCLC可能是通過調控上述基因表達,抑制了腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移并促進了其凋亡。腫瘤壞死因子作為一種重要的細胞因子,能夠誘導包括細胞凋亡、炎癥及免疫等多種細胞內信號通路[65],進而介導腫瘤細胞凋亡的效應。此外,腫瘤壞死因子通路還與PI3K-Akt信號通路級聯(lián)。PI3K-Akt信號通路調節(jié)著基本的細胞功能,如轉錄、翻譯、增殖等,AKT作為該通路的中心環(huán)節(jié),AKT被激活后,可以通過磷酸化參與細胞凋亡、蛋白質合成、代謝等生物過程,進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上,“黃芪-半夏”藥對可能通過槲皮素、山奈酚、黃芩素等主要活性成分,作用于TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA等相關靶點,干預Pathways in cancer、腫瘤壞死因子、PI3K-Akt等信號通路,協(xié)同產生調控腫瘤細胞周期、介導腫瘤細胞凋亡、抑制其增殖分化及轉移等來防治NSCLC。值得一提的是,EGFR是NSCLC的重要驅動因子之一,TP53作為EGFR突變型NSCLC最常見的共突變基因,已被證明是多代EGFR-TKIs治療預后差的重要因素[66],本研究表明“黃芪-半夏”藥對能夠同時作用于TP53、EGFR靶點,這可能是改善EGFR-TKI耐藥,影響療效、生存和預后的關鍵?；诖?后續(xù)將進行實驗研究證實 “黃芪-半夏”藥對治療非小細胞肺癌機制,并進一步確定“黃芪-半夏”藥對發(fā)揮最大療效的配伍劑量與配伍比例。