黃莉 譚輝 孫宇潔 李慧 董昌武**

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,安徽 合肥 230038)

牛膝為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataBlume)的干燥根,該藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,又稱懷牛膝、山莧菜、百倍、牛莖等?！侗静萜穮R精要·草部上品之上》言:“懷州者為佳?！睉阎菁词墙裉斓暮幽辖棺鳌?jì)源地域,道地藥材懷牛膝歷史悠久、質(zhì)量優(yōu)良、精耕細(xì)作、療效顯著,《藥品化義·卷七·腎藥》中有關(guān)于其性味歸經(jīng)的描述:“性涼,能沉,力滋陰活血……入腎、肝二經(jīng)。”現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),牛膝含有糖類、皂苷類、生物堿類、植物甾醇類、黃酮類等多種化學(xué)成分,藥理作用主要有降血壓、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老等[1]。

高血壓(hypertension)以動脈血壓升高為基本特征,是一種遺傳與環(huán)境兩種因素交互作用所導(dǎo)致的心血管綜合征,是心血管疾病最主要的危險(xiǎn)因素。從中醫(yī)角度分析,高血壓的癥狀表現(xiàn)可歸于“厥證”“頭痛”“眩暈”等范疇,高血壓發(fā)病的病機(jī)可總歸于本虛標(biāo)實(shí),虛者多因年老體弱、病后體虛、勞倦過度等致氣血虧虛、髓海虧虛、肝腎不足,甚而陰陽兩虛;實(shí)者多責(zé)于風(fēng)、火、痰、濕、瘀上擾清竅,或肝郁化火,或痰濁中阻,或瘀血阻絡(luò)等[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,隨著我國老齡化人口比重逐漸增大,生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)等因素的變化,而陰虛陽亢型在各類高血壓中所占比例最高[3]。雖然臨床西藥降壓效果顯著,但遺留副作用仍高居不下,尋求中醫(yī)藥整體調(diào)治成為臨床的優(yōu)先選擇趨勢。數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn),懷牛膝在治療高血壓的核心藥物中屬于高頻用藥[4],是常用的活血化瘀中藥,具有明確的降壓效果且對靶器官具有一定的保護(hù)作用[5]。以鎮(zhèn)肝息風(fēng)湯一方降壓作用為例,該方重用懷牛膝為君藥,取其補(bǔ)肝腎、活血通經(jīng)、引血下行之功,現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),牛膝所含的牛膝總皂苷可明顯降低卒中型自發(fā)性高血壓大鼠血壓,在抑制去甲腎上腺素引起的血管收縮的同時(shí)還能舒張血管平滑肌[6]。本文擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初步探究懷牛膝降血壓的生物學(xué)過程,從靶點(diǎn)、信號通路的角度揭示其降壓機(jī)制,為實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1懷牛膝活性成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)檢索懷牛膝的化學(xué)成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出活性成分較高的化合物,并從該網(wǎng)站獲取活性成分對應(yīng)蛋白作用靶點(diǎn),檢索時(shí)間截止至2021年3月27日,建立懷牛膝活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.2高血壓相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 將“Hypertension”作為關(guān)鍵詞,分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)進(jìn)行檢索,將檢索結(jié)果合并去除重復(fù),作為疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫備用。

1.3懷牛膝-高血壓靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venn在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將懷牛膝活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)和高血壓靶點(diǎn)取交集。通過上文搜集的活性和靶點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系建立“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),并運(yùn)用Cytoscape3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析及圖像的處理。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))的構(gòu)建 將篩選得到的藥物-疾病交集靶點(diǎn)上傳至String(https://string-db.org/)在線平臺數(shù)據(jù)庫,建立蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),限定研究物種為“人”(“Homo sapiens”),參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5GO功能分析和KEGG通路富集分析 為了進(jìn)一步分析懷牛膝作用于高血壓的相關(guān)機(jī)制,將懷牛膝的關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David 6.8(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/,Version 6.8),設(shè)定研究對象為人(Homo sapiens),進(jìn)行基因功能(GO,gene ontology)分析以了解靶點(diǎn)生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三方面的作用過程。利用R語言3.6.3中的“clusterProfiler”包對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,https://www.kegg.jp/)富集分析,clusterProfiler優(yōu)勢在于可以實(shí)時(shí)抓取KEGG最新版本注釋得到更具時(shí)效性的富集注釋結(jié)果。以P<0.01進(jìn)行靶基因篩選,得到懷牛膝靶點(diǎn)主要的生物過程和藥理作用機(jī)制中可能性較大的通路。

1.6關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接 從RSCB數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu),使用AutoDockTools 1.5.6軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的水分子刪除,進(jìn)行加氫處理,并且進(jìn)行電荷計(jì)算,輸出為pdbqt格式文件保存。從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載篩選出的懷牛膝活性成分3D結(jié)構(gòu),保存為SDF格式文件,利用Chem3D 17.0軟件和PyMOL進(jìn)行蛋白小分子結(jié)構(gòu)處理,再上傳化合物文件使其能量最小化,最后運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對接,再使用PyMOL軟件對對接結(jié)果進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)可視化分析。

2 結(jié)果

2.1懷牛膝活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到176個(gè)懷牛膝潛在活性成分,以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件,并篩去無對應(yīng)靶點(diǎn)的成分,最終獲得16個(gè)潛在的有效成分(表1)。

表1 懷牛膝潛在有效成分

2.2懷牛膝活性成分-高血壓靶點(diǎn)預(yù)測 從DrugBank數(shù)據(jù)庫整合后得到16種活性成分靶點(diǎn)363個(gè),通過Unipot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,匯總?cè)ブ睾蟮玫?83個(gè)靶點(diǎn)。設(shè)置relevance score≥7,由GeneCards、OMIN數(shù)據(jù)庫檢索整合去重后得到高血壓靶點(diǎn)1010個(gè),將活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)取交集,得到活性成分-疾病靶點(diǎn)76個(gè),繪制的韋恩圖,見圖1。

圖1 藥物與疾病共有作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3“化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 將76個(gè)共同靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建懷牛膝、高血壓“化合物-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),結(jié)果顯示,懷牛膝發(fā)揮降壓作用的潛在活性成分主要有槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、漢黃芩素(wogonin)等,協(xié)同作用于PTGS2、PTGS1、PPARG、ADRB2、AR、CASP3、AKT1、ESR1、NOS2等靶點(diǎn)。

綠色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn),紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表藥對有效成分化合物,紅色菱形代表高血壓,藍(lán)色平行六邊形代表牛膝,灰色線條代表相互作用關(guān)系。

2.4懷牛膝治療高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò) 設(shè)置置信度大于0.4,將Venn圖獲得的76個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺得到PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。據(jù)Count值篩選列舉出懷牛膝治療高血壓排名前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白(圖4),主要包括IL-6、AKT1、VEGFA、CCL2、MMP9、NOS3、IL-1B等。

圖3 懷牛膝治療高血壓相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 懷牛膝治療高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖5 懷牛膝活性成分治療高血壓靶點(diǎn)的GO富集分析柱狀圖

2.5GO功能富集分析 利用DAVID 6.8平臺進(jìn)行GO功能富集分析,設(shè)定P<0.05,對篩選得到的76個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析,這些靶點(diǎn)主要涉及reactive oxygen species metabolic process、response to lipopolysaccharide、response to molecule of bacterial origin等307條生物過程。CC分析可以看出靶點(diǎn)主要涉及membrane raft、membrane microdomain、membrane region等35條細(xì)胞組分。MF分析中可以看出,靶點(diǎn)主要涉及heme binding、tetrapyrrole binding、oxidoreductase activity等54條分子功能。

2.6懷牛膝治療高血壓KEGG通路富集分析 使用clusterprofiler R包對76個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析,以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到的60條KEGG通路富集,前20條通路富集見表2、圖6,主要是AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、內(nèi)分泌抵抗、Toll樣受體信號通路等。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG通路富集分析

2.7關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接分析 分析化合物-靶點(diǎn)-高血壓的網(wǎng)絡(luò)圖,從16種活性化合物中選取連接靶點(diǎn)數(shù)較多、綜合評分較高的的槲皮素、山奈酚、豆甾醇以及漢黃芩素,并選擇靶點(diǎn)PTGS1(PDB ID:6y3c)、PTGS2(PDB ID:5f19)、NOS2(PDB ID:6jwm)、ADRB2(PDB ID:6kr8)、PPARG(PDB ID:3e00)、AR(PDB ID:3btr)、CASP3(PDB ID:2dko)、AKTI(PDB ID:1unq)、ESR1(PDB ID:1hcq)、JUN(PDB ID:1s9k)與上述4種活性化合物分別進(jìn)行分子對接,結(jié)果見表3。結(jié)合能小于0提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合,且結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定結(jié)合能越低,發(fā)生作用的可能性越大[7]。結(jié)果顯示,槲皮素與PTGS2,山奈酚與PTGS1、ESR1、JUN,豆甾醇與PTGS2、CASP3、ESR1,漢黃芩素與CASP3、AR的結(jié)合能較低。選取部分結(jié)合較好的對接結(jié)果,進(jìn)行三維對接情況分析,見圖7。

圖7 懷牛膝活性成分與PTGS2、ESR1、JUN、CASP3分子對接三維圖

表3 懷牛膝活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能(kcal/mol)

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),通過建立懷牛膝治療高血壓的作用網(wǎng)絡(luò)分析其潛在機(jī)制,綜合分析表1及圖2結(jié)果,懷牛膝主要有效化合物有16個(gè),其治療高血壓的可能關(guān)鍵成分有6個(gè),為槲皮素、山奈酚、豆甾醇、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇。槲皮素可減少氧化應(yīng)激反應(yīng),亦可干擾RAAS,改善血管內(nèi)皮素-1(ET-1)和NO平衡,從而改善血管內(nèi)皮功能,降低血壓[8]。山奈酚可通過內(nèi)皮依賴性舒張血管,以此機(jī)制抑制血管緊張素Ⅱ?qū)е碌难苤貥?gòu),還可通過抑制IKK/NF-κB炎癥損傷IRS-1改善Ⅱ型糖尿病大鼠的胰島素抵抗,并對其具有調(diào)血脂作用[9]。黃芩素可通過抑制左心室膠原蛋白和12-脂氧合酶的表達(dá),下調(diào)MMP-9和ERK的活性[10],緩解自發(fā)性高血壓小鼠的心肌纖維化。漢黃芩素可抑制甘油二酯在胞內(nèi)的積聚和蛋白激酶C的磷酸化,從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡,緩解動脈粥樣硬化[11]。豆甾醇、β-谷甾醇可作用β1AR、β2AR靶點(diǎn),影響鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)[12],還能改善脂質(zhì)代謝過程,預(yù)防動脈粥樣硬化。

研究表明,高血壓的發(fā)病主要與RAAS激活、交感神經(jīng)活動亢進(jìn)、水鈉潴留、胰島素抵抗、膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常及血管內(nèi)皮功能紊亂等有關(guān)[13],血壓受自主神經(jīng)系統(tǒng)和NO、ET-1等體液機(jī)制雙重調(diào)控。結(jié)合圖1、2、3、4可知,懷牛膝對應(yīng)有效作用靶點(diǎn)183個(gè),高血壓靶點(diǎn)1010個(gè),交集靶點(diǎn)76個(gè),其中關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有IL6、AKT1、VEGFA、CCL2、MMP9、NOS2、NOS3、PTGS1、PTGS2、PPARG、ADRB2、AR、CASP3、ESR1、JUN、IL-1B等,這些靶點(diǎn)涉及到活性氧代謝過程、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、管徑調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。IL-6、IL-1B在心血管疾病發(fā)生上主要介導(dǎo)血管內(nèi)炎性反應(yīng)[14],IL-6可使血管平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞增殖,產(chǎn)生大量血小板衍生因子,促進(jìn)血小板數(shù)量增多,循環(huán)阻力增加而使血壓升高。IL-1B也可刺激并增殖血管平滑肌細(xì)胞,改變細(xì)胞膜上的Ca2+滲透性,使血管收縮而致血壓升高。AKT1參與糖脂代謝,而糖代謝異常與高血壓前期病變互為因果。此外,還能促進(jìn)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,在高血壓導(dǎo)致的心肌纖維化中發(fā)揮重要作用[15]。CCL2是最廣泛的趨化因子之一,高血壓時(shí)因血流動力學(xué)因素、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等作用CCL2的表達(dá)會隨之增加[16]。VEGFA是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因子,與血管損傷、動脈粥樣硬化密切相關(guān),與血壓升高呈正相關(guān)[17]。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族,其增高會引起細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白的重構(gòu),使Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白含量升高,在高血壓動脈重塑過程中發(fā)揮重要作用[18]。NOS是一種同工酶,NOS2和NOS3是其亞型,NOS2變異表達(dá)異常,通過氟他胺代謝導(dǎo)致高血壓的發(fā)生,NOS3變異含量改變,可能通過影響異丙酚的代謝而影響血壓[19]。ADRB2調(diào)節(jié)骨骼肌肌糖原分解及血管平滑肌松弛,與NOS2、NOS3同是調(diào)節(jié)血管舒縮功能的重要介質(zhì)。ESR1能促進(jìn)NOS的表達(dá),從而增加血管內(nèi)一氧化氮的釋放,舒張血管。PTGS有組成型(PTGS1)和誘導(dǎo)型(PTGS2)兩種同工酶,它們可與前列環(huán)素受體G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合,從而激活G蛋白,升高環(huán)磷酸腺苷水平,進(jìn)而抑制血小板聚集,降低血液粘稠度抗血管收縮[20]。PPARG屬于核激素受體超家族,可與相關(guān)的配體結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)脂類的分解代謝、能量的代謝[21]。Caspase家族大部分參與細(xì)胞凋亡起始、執(zhí)行,其中CASP3直接參與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體的形成。

富集的分子功能主要包括血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、氧化還原酶活性、細(xì)胞因子活性、整合素結(jié)合、腎上腺素能受體活性、受體配體活性、類固醇激素受體、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等方面。KEGG通路富集分析顯示,這些靶點(diǎn)參與了AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、松弛素信號通路、Toll樣受體信號通路等的調(diào)控。AGE-RAGE信號通路與心臟血管發(fā)揮作用密切相關(guān),AGE主要通過修飾蛋白結(jié)合受體RAGE,激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[22]。TNF、IL-17信號通路與炎癥反應(yīng)有關(guān),TNF信號通路異常調(diào)節(jié)會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,平滑肌細(xì)胞增生,血管外周阻力增加而引起高血壓,IL-17信號通路可誘導(dǎo)多種組織和細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶的表達(dá)[23]。松弛素信號通路不僅對機(jī)體的血流動力學(xué)和心肌肥大有調(diào)節(jié)作用,還可參與心肌修復(fù)和再生,逆轉(zhuǎn)心臟纖維化[24]。HIF-1信號通路能調(diào)節(jié)腎臟髓質(zhì)功能、水鹽平衡,HIF-1α可激活HO-1(血紅素氧合酶1)、COX-2(環(huán)氧化酶2)和NOS等基因表達(dá),促進(jìn)尿鈉排泄[25]。此外,還可通過調(diào)節(jié)凋亡減輕缺血再灌注損傷,保護(hù)心肌功能。Toll樣受體信號通路中TLR4介導(dǎo)先天及適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與高血壓慢性血管炎性反應(yīng)過程,主要因?yàn)門LR4介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷,增強(qiáng)血管反應(yīng)性[26]。

綜上,本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為依托,通過建立網(wǎng)絡(luò)從整體上分析懷牛膝成分、靶點(diǎn)、信號通路之間的相互作用關(guān)系,推測中藥懷牛膝通過槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素、豆甾醇、β-谷甾醇等黃酮類、甾醇類潛在藥效成分協(xié)同作用于IL6、AKT1、VEGFA、CCL2、MMP9、NOS2、NOS3、PTGS1、PTGS2、PPARG、ADRB2等多個(gè)靶點(diǎn),通過AGE-RAGE信號通路等多個(gè)通路,參與血管舒縮、鈣鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝、氧化應(yīng)激等發(fā)揮治療高血壓的作用,初步揭示了懷牛膝通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮降壓作用的機(jī)制。為進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供方向,其后續(xù)尚需體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點(diǎn)。