張平香 魏朝輝, 鄭程鵬, 張潯 張棋 蔣佳輝 羅楊志 喻運珍, 艾桃山, 張立強, 朱文歡 黃天樂 鄧平,

(1 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,武漢 430207; 2 武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司,武漢 430070; 3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,武漢 430070; 4 洪湖市水產(chǎn)發(fā)展中心,湖北洪湖 433200; 5 武漢市水產(chǎn)技術(shù)推廣指導(dǎo)中心,武漢 430014)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗稱黃臘丁,是一種底棲小型雜食性魚類,是我國重要的名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一。近年來,黃顙魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加,據(jù)報道,2003—2018年我國黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的年平均增長速率達16.38%,2018年全國黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量約為50萬噸,占全國淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的2%左右,產(chǎn)地主要集中在湖北、湖南、四川、廣東等地[1]。隨著黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加,養(yǎng)殖密度增大,病害問題越來越顯現(xiàn)出來,尤其是由細菌引起的細菌性疾病嚴(yán)重。養(yǎng)殖水體惡化,養(yǎng)殖戶盲目使用藥物,也使得病害問題愈加嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計,細菌性疾病每年給黃顙魚養(yǎng)殖帶來上億元的經(jīng)濟損失。

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科、氣單胞菌屬(Aeromonas),在生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[2],已被確認(rèn)為水產(chǎn)動物的原發(fā)性或繼發(fā)性病原[3-7]。1989年,首次從烏鱧身上分離得到維氏氣單胞菌[8],之后陸續(xù)在觀賞魚[9]、歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)[10]、團頭魴[11]、黃鱔[12]、中華絨螯蟹[13]及黃顙魚[14]中分離得到,主要癥狀為體表潰瘍出血,腹水,脾腎結(jié)節(jié)、腫大等。維氏氣單胞菌是養(yǎng)殖黃顙魚常見的病原菌之一。

本研究對湖北省某養(yǎng)殖場的患病黃顙魚進行病原分離,得到了1株致病菌株。通過對其進行形態(tài)學(xué)觀察、16S rRNA基因序列測定,確定該菌株為維氏氣單胞菌。同時,選取訶子、五倍子、穿心蓮、烏梅、連翹、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿等10種具有較好抑菌效果的中草藥,測定這10種中草藥對該菌的抑菌效果,旨在為用中草藥防治維氏氣單胞菌病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來源

患病黃顙魚采自湖北省某養(yǎng)殖場。病魚主要表現(xiàn)為漫游,體表潰瘍出血,腹水。在無菌條件下取樣病魚的肝臟、脾臟,進行實驗室病原分離培養(yǎng)。

1.2 試劑和材料

BHI培養(yǎng)基(腦心浸液肉湯)購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。10×Buffer(緩沖液)、dNTP、TaqDNA聚合酶、切膠回收試劑盒、pMD18-T Vector載體及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自寶生物工程(大連)有限公司。所有化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。實驗相關(guān)引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成,核酸序列測序均由天一輝遠生物科技有限公司完成。

10種中草藥(訶子、五倍子、穿心蓮、烏梅、連翹、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿)來自武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司。鹽酸多西環(huán)素與氟苯尼考購自上海沃凱藥業(yè)有限公司。

1.3 病原菌的分離與純化

取具有典型癥狀的瀕死黃顙魚,經(jīng)體表消毒后,于無菌條件下分別取其肝臟和腎臟涂于BHI瓊脂平板上并劃線,28 ℃培養(yǎng)24 h后,挑取單個菌落于相同條件下進行純化培養(yǎng)。在純化后的培養(yǎng)物中挑取單個菌落進行擴大培養(yǎng),加裝甘油(終濃度為50%)于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將獲得的單一形態(tài)的菌株命名為H1。

1.4 16S rRNA基因序列分析

實驗采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取細菌DNA。提取后的細菌DNA經(jīng)核酸電泳驗證后,置于-20 ℃冰箱保存。擴增引物為[15]:16S-F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,16S-R:GGTTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)總體系25 μL:DNA模板0.5 μL,上、下游引物各1 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2.5 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,去離子滅菌水17.3 μL。

16S rRNA基因擴增反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的片段,進行T載體克隆,并對重組質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果比對拼接后在NCBI上在線分析。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株H1與其他氣單胞菌屬的16S rRNA核酸序列進行比較分析,利用Clustal X軟件進行比對排列,采用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,用Neighbour-joining方法和Kimura 2-parameter校正軟件進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過自舉分析(Bootstrap)進行1 000次重復(fù)檢測,分析系統(tǒng)的置信度。

1.6 中草藥水提液制備

10種中草藥分別為:訶子、烏梅、連翹、五倍子、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿、穿心蓮。

中草藥水提物制備[16]:將10種中草藥各稱取10 g分別放入燒杯中,加水煎煮2次,每次煮沸30 min,集中2次煮出的藥液進一步煎煮,濃縮至10 mL,濃縮液經(jīng)高壓滅菌后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 最低抑菌濃度的測定

根據(jù)水產(chǎn)抗菌藥物抗菌作用的測定方法,采用兩倍稀釋法,于第1支裝有1 mL無菌液體培養(yǎng)基的試管中加入供試原藥液1 mL,充分混合后,取出1 mL加入第2支試管中,依次類推至第14支試管,從第14支試管中取出1 mL棄去,第15支試管不加藥物,為對照管。在每支試管中加入配置好的H1菌液0.1 mL,充分混勻后,置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24～48 h,經(jīng)肉眼觀察證實無菌生長的試管中的藥物濃度,即為該藥物的最低抑菌濃度(MIC,minimum inhibitory concentration)。每種中草藥設(shè)3個平行組,最低抑菌濃度的結(jié)果取其平均值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計和分析比較,結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的純化分離

H1菌落呈灰白色,半透明,圓形,中間隆起,邊緣整齊,表面濕潤、光滑。經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色,為革蘭氏陰性菌(見圖1)。

圖1 分離株的平板菌落及革蘭氏染色圖

2.2 16S rRNA序列分析

采用試劑盒提取H1菌株的DNA,以其為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得的目的片段長約1 500 bp(見圖2)。

注:Marker為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);H1為H1菌株的16S rRNA PCR產(chǎn)物。

2.3 系統(tǒng)進化分析

將測序結(jié)果在NCBI中在線比對,結(jié)果表明,菌株H1所測序列與維氏氣單胞菌(A.veronii)的同源性很高。從最相近的同源性較高的氣單胞菌屬序列中進行選擇,并以大腸桿菌和愛德華氏菌為外群,進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示,菌株H1與A.veronii(MT228974.1、MG063203.1)聚為一支(見圖3)。

圖3 以菌株H1的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 最低抑菌濃度

10種中草藥以及鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考對維氏氣單胞菌H1菌株的抑菌結(jié)果見表1。從表1中可以看出,訶子、五倍子、穿心蓮有較好的抑菌效果,其中訶子的抑菌效果最好;烏梅、連翹、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿的抑菌效果較差,其中五味子的抑菌效果最差。

表1 藥物對H1菌株的最低抑菌濃度

3 討論

中國具有全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模,同時也面臨著嚴(yán)峻的魚類病害問題。由于養(yǎng)殖病害問題逐年增加,抗生素等藥物濫用等導(dǎo)致的水環(huán)境污染、細菌耐藥性增加及食品安全等一系列問題[17-18]嚴(yán)重制約了水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的發(fā)展,因此,開發(fā)能有效防治疾病且對環(huán)境友好的藥物對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。

中草藥具有天然性、安全性、低值高效性,其含有的糖類、有機酸、生物堿、苷類和揮發(fā)油等物質(zhì)具有抗菌殺菌作用[19]。本研究以訶子、烏梅、連翹、五倍子、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿、穿心蓮等10種中草藥水提物為研究對象,檢測其對維氏氣單胞菌的抑菌效果,結(jié)果顯示,訶子、五倍子、穿心蓮有較好的抑菌效果,其中訶子的抑菌效果最好;烏梅、連翹、五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿的抑菌效果則較差。張生元等[20]采用以上10種中草藥對柱狀黃桿菌的抑菌試驗結(jié)果表明,訶子抑菌效果最好,連翹、烏梅和五倍子抑菌效果次之,而五味子、秦皮、魚腥草、牡丹皮、青蒿、穿心蓮的抑菌效果較差;晉鵬飛等[21]研究發(fā)現(xiàn),訶子和五倍子的提取物對嗜水氣單胞菌具有較好的抑菌效果;張桓橋等[22]的研究表明,中草藥復(fù)方(五倍子∶地榆∶訶子∶蘇木∶黃芩∶黃連=4∶4∶2∶5∶3∶1)具有較好的抑菌效果。以上報道與本研究結(jié)果基本一致。

現(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明,訶子、五倍子、穿心蓮的提取物都具有抗菌作用[23-25]。訶子所含的三萜類成分、五倍子所含有的鞣酸、穿心蓮所含有的二萜內(nèi)酯類化合物具有顯著的抗菌作用[26-28],與本研究的結(jié)果相符合。因此,有必要對訶子、五倍子、穿心蓮復(fù)配的抑菌效果進行研究,以期開發(fā)出高效、低副、無毒的復(fù)方中草藥,發(fā)揮中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物細菌性疾病防治中的重要作用。