徐博文 張國奇 周陸 張友良 王軍 王成輝

(1 上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 2 上海松江水產(chǎn) 良種場有限公司,上海 201616; 3 上海市松江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 201616)

翹嘴鲌(Culteralburnus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Cultrinae)、鲌屬(Culter),是我國重要的經(jīng)濟魚類,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要的地位[1]。翹嘴鲌具有體形好、廣溫性、生長快及肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良性狀和較高的經(jīng)濟價值[2],深受養(yǎng)殖戶和消費者喜愛。翹嘴鲌在我國分布范圍廣,從我國的臺灣、珠江流域、長江干流、長江支流(淮河)一直到黑龍江流域等幾大水系均有分布。翹嘴鲌不同的地理群體具有不同的種質(zhì)遺傳特性。史建伍等[3]基于隨機擴增多態(tài)性(RAPD)方法對鄱陽湖、梁子湖以及太湖的3個不同翹嘴鲌地理群體進行了遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)鄱陽湖群體與梁子湖群體親緣關(guān)系較近,與太湖群體稍遠。伊西慶[4]用線粒體ND2基因分析了興凱湖與5個翹嘴鲌地理群體間的遺傳差異,結(jié)果表明,興凱湖群體與其他群體間存在極顯著的遺傳分化(P<0.01)。王偉[5]應(yīng)用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(ISSR)核DNA分子標(biāo)記和線粒體COII、D-LOOP標(biāo)記對我國太湖、興凱湖、梁子湖、浮橋河水庫、三溪口水庫、南灣水庫以及湖州人工養(yǎng)殖池塘等7個不同地理群體翹嘴鲌進行了遺傳多樣性比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),興凱湖群體、南灣水庫群體和太湖群體的遺傳多樣性要高于其他群體,并根據(jù)各群體遺傳特征呈現(xiàn)的差異性,首次提出將翹嘴鲌分為南、北兩大區(qū)系。

我國在翹嘴鲌胚胎發(fā)育研究方面已有不少報道。顧志敏等[6]對太湖翹嘴鲌進行了胚胎及胚后發(fā)育觀察,指出翹嘴鲌受精卵為圓球型,呈墨綠色、青灰色、黃色3種顏色,為黏性卵,并且對其胚胎發(fā)育特征進行了詳細的描述。劉丹陽等[7]對興凱湖翹嘴鲌的胚胎發(fā)育進行了觀察,指出其受精卵呈淡黃綠色或青灰色,為半浮性卵,無黏性。上述兩個研究表明,由于地理隔離,北方的興凱湖群體與南方的長江流域群體,其受精卵呈現(xiàn)出了不同特性。然而,翹嘴鲌南、北方群體的受精卵差異是否是由于長期的環(huán)境適應(yīng)性演化造成的,還有待進一步探討。研究翹嘴鲌南、北方群體在同一環(huán)境下的受精卵和繁殖特性,將為后續(xù)翹嘴鲌的人工養(yǎng)殖以及遺傳育種提供重要參考。

核型是指一個細胞內(nèi)有絲分裂中期所有染色體的表型,如染色體數(shù)目、大小和形態(tài)特征等。核型分析研究不僅可以在分類系統(tǒng)中探討物種地位,了解系統(tǒng)的演化過程,還可以為一些重要養(yǎng)殖種類的雜交育種及分子生物學(xué)研究等提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)[8]。按照Levan等[9]的分類標(biāo)準(zhǔn),染色體可分為中著絲粒染色體(m)、亞中著絲粒染色體(sm)、端部著絲粒染色體(t)、亞端著絲粒染色體(st)4種類型。國內(nèi)對翹嘴鲌染色體的核型分析已有一些報道,但存在較大差異。如王曉艷等[10]發(fā)現(xiàn),洞庭湖翹嘴鲌染色體數(shù)目為2n=48(n為配子體的染色體個數(shù)),核型公式為18m+10sm+18st+2t,染色體總臂數(shù)(NF)為76條;楊曉芬等[11]報道的貴州地區(qū)翹嘴鲌的核型公式則為16m+26sm+6st,NF=90;而趙春霞等[12]研究發(fā)現(xiàn),興凱湖翹嘴鲌染色體數(shù)目為2n=48,核型公式為16m+16sm+12st。翹嘴鲌南、北方群體在染色體數(shù)目和核型上的較大差異需要進一步的研究和確認。

本研究對來自南方淀山湖以及北方興凱湖的翹嘴鲌群體的胚胎發(fā)育過程進行了系統(tǒng)的觀察比較,并通過染色體核型分析探究兩個群體的遺傳差異,旨在了解分布在南、北方不同區(qū)域翹嘴鲌群體間的變異程度及其繁育的環(huán)境適應(yīng)性,為翹嘴鲌種質(zhì)資源的進一步挖掘和利用提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

翹嘴鲌北方群體樣本采自黑龍江興凱湖,南方群體樣本采自長江水系(上海淀山湖)。兩個群體的親魚培育均在上海市松江水產(chǎn)良種場進行,管理方法一致。本試驗于2020年5月進行翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的人工繁育。

1.2 胚胎發(fā)育

1.2.1 授精與孵化條件

挑選性腺發(fā)育良好的親魚進行人工催產(chǎn)。雌性親魚注射促黃體生成素釋放激素類似物L(fēng)RH-A(15 U/kg)和地歐酮(1.5 U/kg);雄性親魚劑量減半。在注射催產(chǎn)劑12 h后,采用干法人工授精,然后將受精卵平鋪于培養(yǎng)皿中進行孵化。通過溫度計實時監(jiān)控水溫變化情況。

1.2.2 胚胎發(fā)育觀察

參考王云等[13]的方法,在顯微鏡下觀察胚胎各發(fā)育時期的特征,當(dāng)半數(shù)胚胎發(fā)育至某時間點時作為該期的胚胎發(fā)育時間,記錄并拍照。

1.2.3 繁育相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計分析

翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體各取3個生物學(xué)重復(fù),統(tǒng)計它們的相對繁殖力、卵徑大小、受精率和出膜后體長。相對繁殖力采用李思發(fā)[14]的方法,即相對繁殖力=卵粒總和(粒)/體質(zhì)量(g);受精率為原腸期正常受精卵數(shù)與總卵數(shù)之比[13];卵徑和出膜后體長均在顯微鏡下觀察并測量。相關(guān)數(shù)據(jù)用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,利用SPSS 21.0軟件進行t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 核型分析

1.3.1 染色體制備

參照孫遠東等[15]的方法,在試驗魚的胸鰭基部注射植物血凝素(PHA)溶液(10 μg/g);12 h后在同一部位再次注射PHA(15 μg/g);作用3 h后,在相同部位第3次注射PHA(10 μg/g),同時在另一側(cè)胸鰭基部注射秋水仙素(colchicine)(4～6 μg/g)。1.5～2.0 h后,斷魚尾放血2～3 min,隨后取魚腎臟,用手術(shù)剪剪碎后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,猛烈吹打制成細胞懸液;離心后收集細胞,棄上清液,加入KCl溶液(0.075 mol/L)低滲處理,隨后加入新鮮配制的卡諾固定液(甲醇與冰醋酸體積比3∶1,并提前-20 ℃預(yù)冷);取預(yù)冷的干凈載玻片,從載玻片高處進行滴片,之后將載玻片在酒精燈上過火15～20次,再用Giemsa染色液染色1～2 h,最后封片,鏡檢。

1.3.2 染色體觀察與核型編排

在光學(xué)顯微鏡下觀察翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的染色體形態(tài),記錄并拍照。使用Photoshop軟件對圖片進行觀察和測量,首先確定著絲粒的位置,然后通過軟件自帶的測量功能,測量每條染色體著絲粒到染色體臂末端的距離,得到染色體的相對臂長。按照Levan等[9]的染色體分類標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)臂比值(長臂臂長/短臂臂長)將染色體分為m、sm、t、st共4組,并根據(jù)染色體長度及臂比值對其進行兩兩配對、編號并排序。

2 結(jié)果

2.1 翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的繁育性能比較

翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的相對繁殖力、卵徑、受精率、出膜后體長情況見圖1。南方淀山湖群體的相對繁殖力(相對懷卵率)略高于北方興凱湖群體,但差異不顯著(P>0.05),而北方興凱湖群體的卵徑為(1.21±0.03)mm,極顯著大于南方淀山湖群體[(1.11±0.05)mm](P<0.01)。北方興凱湖群體的受精率為96.8%,略高于南方淀山湖群體的94.5%,但差異不顯著(P>0.05)。翹嘴鲌北方興凱湖群體仔魚的出膜后體長為(5.77±0.29)mm,極顯著大于南方淀山湖群體[(3.40±0.14)mm](P<0.01)。

2.2 翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的胚胎發(fā)育特征和時序比較

2.2.1 受精卵

翹嘴鲌南方淀山湖群體的受精卵黏性很強,卵膜較厚,不易剝離,呈灰黃色,吸水后膨脹不明顯。北方興凱湖群體的受精卵無黏性,為浮性卵,卵膜較薄,呈青灰色,吸水后體積膨脹明顯。兩個群體的胚胎發(fā)育特征和時序見表1、圖2。

2.2.2 胚盤期

卵內(nèi)出現(xiàn)帽狀隆起,形成胚盤。南方淀山湖、北方興凱湖群體在此期的發(fā)育時序和形態(tài)均無較大差異,但南方淀山湖群體進入胚盤期的時間相對較短。

注:**表示組間差異極顯著(P<0.01)。

表1 水溫(25±1)℃條件下翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的胚胎發(fā)育時序

2.2.3 細胞期

胚盤逐漸發(fā)育出分裂溝,胚胎不斷地以倍數(shù)分裂,此為多細胞期。此后,受精卵繼續(xù)經(jīng)過數(shù)次卵裂形成大量緊密的細胞團,呈桑葚狀,進入桑葚期。南方淀山湖、北方興凱湖群體進入桑葚期的歷時和形態(tài)特征無明顯差異。

2.2.4 囊胚期

南方淀山湖、北方興凱湖群體在此期的發(fā)育胚胎外部特征相似,在受精4 h后形成囊胚腔,囊胚層向下逐漸延伸,分裂球之間已無明顯界限。囊胚層繼續(xù)向下延展,1/3的胚胎被其包裹。但南方淀山湖群體較北方興凱湖群體進入囊胚期的歷時更短。

注:1. 受精卵;2. 胚盤期;3. 2細胞期;4. 4細胞期;5. 8細胞期;6. 16細胞期;7. 32細胞期;8. 桑葚期;9. 囊胚早期;10. 囊胚中期;11. 囊胚晚期;12. 原腸早期;13. 原腸中期;14. 原腸晚期;15. 神經(jīng)胚期;16. 胚孔閉合期;17. 眼基出現(xiàn)期;18. 眼囊期;19. 尾芽期;20. 晶體出現(xiàn)期;21. 肌動期;22. 出膜前期;23. 出膜期;24. 1日齡。

2.2.5 原腸期

出現(xiàn)新月狀的胚環(huán),囊胚層繼續(xù)向下延展,直至包裹住2/3的胚胎,進入原腸中期。囊胚層繼續(xù)向下延展至胚胎的3/4,囊胚層開始增厚。形態(tài)上南方淀山湖、北方興凱湖群體的發(fā)育胚胎外部特征無異,而南方淀山湖群體在原腸期發(fā)育開始變緩,發(fā)育時長較北方興凱湖群體胚胎有所增加。

2.2.6 神經(jīng)胚期

南方淀山湖、北方興凱湖群體的發(fā)育胚胎外部特征無明顯差異,胚層下包至4/5處,逐漸形成卵黃栓。胚環(huán)前段不斷變大形成腦泡,此為神經(jīng)胚期。南方淀山湖群體胚胎從原腸期至神經(jīng)胚期發(fā)育均較為緩慢。

2.2.7 胚孔閉合期

隨著胚層進一步下包,卵黃變成不規(guī)則圓形,外露漸小,最后卵黃栓消失,在卵黃栓末端形成圓形有凹陷的胚孔。胚孔逐漸變小直至封閉。此時期南方淀山湖、北方興凱湖群體的胚胎在形態(tài)特征上相似,發(fā)育時序也大致相同,但南方淀山湖群體胚胎發(fā)育開始加快。

2.2.8 眼囊期

眼囊期又稱視囊出現(xiàn)期,胚環(huán)前段變大,視泡突出呈橢圓形;尾部逐漸變細長,肌節(jié)逐漸發(fā)育出現(xiàn)。此時期兩個群體胚胎形態(tài)特征一致,但北方興凱湖群體的歷時較長。

2.2.9 肌動期

胚體開始出現(xiàn)一定頻率的收縮,且尾部在不斷擺動。南方淀山湖、北方興凱湖群體胚胎外部特征相近,南方淀山湖群體的胚胎發(fā)育略慢于北方興凱湖群體。

2.2.10 出膜期

胚胎外膜破裂,仔魚開始出膜。仔魚呈透明狀,魚體前端具有一個梭狀的卵黃膜以供營養(yǎng)需求。此時仔魚發(fā)育出部分尾鰭,能間歇性地進行上下垂直游動。形態(tài)上,南方淀山湖、北方興凱湖群體發(fā)育特征相似,北方興凱湖群體的發(fā)育時序略短于南方淀山湖群體,但差異不明顯。北方興凱湖群體仔魚的出膜后體長極顯著大于南方淀山湖群體(P<0.01)。

表2 翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的染色體數(shù)目分布

2.3 染色體數(shù)目與核型

從翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體各挑選100個良好的染色體分裂相進行顯微鏡觀察計數(shù),統(tǒng)計染色體數(shù)目。結(jié)果顯示,南方淀山湖群體中染色體為2n=48的占55%,北方興凱湖群體中染色體為2n=48的占57%(見圖3、表2)。

通過染色體臂比計算,發(fā)現(xiàn)m組臂比值為1.0～1.7,為中著絲粒染色體,南方淀山湖群體共有12對,北方興凱湖群體共有11對;sm組為亞中著絲粒染色體,臂比值為1.7～3.0,南方淀山湖群體共有10對,北方興凱湖群體共有13對;st組臂比值范圍在3.0～7.0,為亞端著絲粒染色體,南方淀山湖群體共有2對。翹嘴鲌南方淀山湖群體的核型公式為2n=24m+20sm+4st,NF=88;翹嘴鲌北方興凱湖群體的核型公式為2n=22m+26sm,NF=96(見圖3、表3)。

注:m為中著絲粒染色體,sm為亞中著絲粒染色體,st為亞端著絲粒染色體。

3 討論

由于生存的地理環(huán)境差異,物種通常會形成具有環(huán)境適應(yīng)性特征的地理群體[16-18]。據(jù)研究報道,南、北方的翹嘴鲌群體具有生長和繁殖習(xí)性的差異,這可能與其環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)[19]。本研究將翹嘴鲌北方興凱湖群體引入南方水體進行培育,并比較了兩者在相同養(yǎng)殖環(huán)境下繁育性能的差異,結(jié)果表明,翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的受精卵存在較明顯的形態(tài)和結(jié)構(gòu)差異。劉丹陽等[7]認為,在人工養(yǎng)殖環(huán)境下,水體的理化因子、餌料來源和營養(yǎng)配比的不同會對翹嘴鲌親魚產(chǎn)生影響,進而導(dǎo)致其受精卵的差異。然而,本研究中的北方興凱湖群體是在上海松江地區(qū)通過人工繁育獲得的,其親魚培育、胚胎發(fā)育的環(huán)境與南方淀山湖群體基本一致。之前的研究也表明,來自北方興凱湖的翹嘴鲌,其受精卵為非黏性卵,與本研究的北方興凱湖翹嘴鲌受精卵特征一致[20]。這說明北方興凱湖翹嘴鲌與南方淀山湖翹嘴鲌受精卵形態(tài)和結(jié)構(gòu)的差異并不是人工養(yǎng)殖環(huán)境影響所致,可能是長期的地理隔離形成的適應(yīng)性演化[21]。本研究還發(fā)現(xiàn),翹嘴鲌北方興凱湖群體的卵徑和出膜后的仔魚體長都顯著大于南方淀山湖群體。有研究認為,卵徑是反映生物生活史進化過程的一個重要的生物學(xué)特征,其大小與環(huán)境相關(guān),是魚類長期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果[22]。據(jù)此推測,翹嘴鲌北方興凱湖群體的繁殖特性是其長期適應(yīng)興凱湖的地理環(huán)境而形成的適應(yīng)性特征,是一種穩(wěn)定遺傳的特征。本研究中,翹嘴鲌北方興凱湖群體在上海松江區(qū)水產(chǎn)良種場進行繁育時仍具有較高的相對繁殖力和受精率,說明其可以在南方水域進行正常繁育。

表3 翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體核型分析參數(shù)(n=4)

染色體是遺傳物質(zhì)的載體,每個物種都具有獨特的染色體組成。魚類的染色體核型類型與其進化存在一定的關(guān)系[23]。通過對翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的染色體核型進行分析可知,南方淀山湖、北方興凱湖群體的染色體數(shù)目均為2n=48,與國內(nèi)絕大多數(shù)已有的關(guān)于翹嘴鲌染色體的報道一致,但與趙春霞等[12]報道的興凱湖翹嘴鲌染色體數(shù)目(2n=44)有所差異。同種魚染色體數(shù)目不一致的現(xiàn)象在大黃魚(Larimichthyscrocea)[24]、馬口魚(Opsariichthysbidens)[25]、花尾胡椒鯛(Plectorhinchuscinctus)[26]、鯽(Carassiusauratus)[27]中均有存在。但本研究的結(jié)果支持北方興凱湖翹嘴鲌的染色體數(shù)為2n=48。雖然翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的染色體數(shù)目均為48條,但其核型存在一定的差異,而此差異同樣可能是長期的地理隔離形成的遺傳變異造成的。導(dǎo)致染色體出現(xiàn)差異的原因可能有以下幾點:(1)不同地理種群在長期的自然選擇條件下產(chǎn)生了適應(yīng)性演化;(2)種內(nèi)核型多態(tài)化現(xiàn)象可能是群體的遺傳多樣性所致[28];(3)試驗操作方法,如PHA和秋水仙素的用量和處理時長均會對染色體的形態(tài)造成一定的影響。盡管翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體的染色體核型存在一定的差異,但整體而言,翹嘴鲌南方淀山湖、北方興凱湖群體應(yīng)屬于同一物種的不同地理種群。

綜上所述,雖然翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體由于長期的地理隔離,種群間可能出現(xiàn)了一定的適應(yīng)性演化,造成其繁殖性能,如卵的特性、相對繁殖力、卵徑、出膜仔魚的體長等有一定的差異,但北方興凱湖翹嘴鲌能夠在南方如上海地區(qū)正常繁育,其相對繁殖力和受精率等重要繁育指標(biāo)仍具有較好的表現(xiàn),并不影響其在南方水體的繁育實踐。關(guān)于翹嘴鲌南方淀山湖群體、北方興凱湖群體的分子遺傳差異仍有待進一步的深入研究。