劉 娣 ，李皓月，馬 紅，汪 亮

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

民豬是我國地方品種，主要分布在東北地區(qū)，具有抗逆性強、肉質(zhì)好、抗寒等特點[1]，脂肪沉積情況直接影響民豬抗寒能力[2]。根據(jù)脂肪組織分布位置不同分為皮下脂肪、肌內(nèi)脂肪及內(nèi)臟脂肪。皮下脂肪占民豬總脂肪含量70%左右，大部分存在于皮下，如背部脂肪、腋下脂肪等，主要發(fā)揮保護、隔熱及儲存能量功能[3]。

microRNA 是內(nèi)源性啟動的非編碼RNA，由19～25個核苷酸組成，通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA 或阻礙其翻譯，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后控制基因表達作用[4]。microRNA已被發(fā)現(xiàn)參與多種生理過程，在細胞增殖、分化、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、脂肪形成等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。miR-19a屬于miR-17-92基因簇，參與脂肪組織的胰島信號轉(zhuǎn)導。miR-19a已被證實促進雞前脂肪細胞增殖[8]，但在民豬中研究較少。

轉(zhuǎn)錄因子KLFs 家族（Krüppel-like factors）是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員，在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要作用[9]。Jiang 等研究發(fā)現(xiàn)，KLF13通過調(diào)節(jié)PPARγ 促進豬脂肪細胞分化[10]。生物信息學分析表明，miR-19a靶作用于KLF13基因。為揭示民豬miR-19a作用及其作用機制，本研究開展miR-19a 靶作用于KLF13 基因鑒定與分析及miR-19a對脂肪分化調(diào)控機制的研究。

脂肪在民豬抗寒過程中發(fā)揮重要作用，本研究通過對miR-19a 靶作用于KLF13 基因的鑒定分析及miR-19a 對脂肪分化標志基因的作用，探究miR-19a對民豬脂肪沉積的影響，為研究民豬脂肪分化過程調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Trizol、DMEM/F12 培養(yǎng)基、熒光定量試劑均購自Life techonogies 公司；Lipofectamine 2000、胰蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）均購自TaKaRa 公司；青鏈霉素混合液、地塞米松（DEX）、三碘甲狀腺原氨酸（T-3）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、羅格列酮、胰島素、Ⅳ型膠原酶、油紅O染液均購自Sigma 公司；MicroRNA 模擬物、抑制劑、NC均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司設(shè)計合成。

1.2 樣品采集

實驗動物取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所養(yǎng)殖基地，采集6月齡東北民豬心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉和皮下脂肪組織用于提取RNA，采集1月齡東北民豬背部皮下脂肪組織用于前體脂肪細胞培養(yǎng)。

1.3 民豬前體脂肪細胞分離培養(yǎng)

取民豬脂肪組織，使用PBS清洗，將組織塊剪碎，加入兩倍體積Ⅰ型膠原酶消化、離心后，取民豬前脂肪細胞，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

待細胞密度長至70%～80%時轉(zhuǎn)染（35 mm皿為例），按照說明書將合適濃度模擬物、抑制劑或NC 與250 μL 的DMEM/F 12 混 勻，5 μL Lipofectamine 2000 與250 μL 的DMEM/F 12 混勻。再將二者混合孵育15 min，逐滴加入培養(yǎng)皿中，24 h后換液。

1.5 前脂肪細胞誘導成脂

前脂肪細胞轉(zhuǎn)染后24 h 換液，更換為2 mL 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗、10%FBS），每毫升培養(yǎng)基中含終濃度1 μmoL a.i.·L-1吲哚美辛、0.5 μmoL a.i.·L-1IBMX、5 ng a.i.·mL-1胰島素、1 μmoL a.i.·L-1羅格列酮、1 μmoL a.i.·L-1地塞米松、1 μmoL a.i.·L-1三碘甲狀腺原氨酸（T3），2 d 后換液，替換成含有終1 μmoL a.i.·L-1三碘甲狀腺原氨酸（T3）、濃度5 ng a.i.·mL-1胰島素、1 μmoL a.i.·L-1羅格列酮的完全培養(yǎng)基（含1%雙抗、10%FBS）。

1.6 RNA提取及RT-qPCR檢測

根據(jù)說明書使用Trizol 法提取RNA，提取的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在LightCycler?96熒光定量PCR儀中進行PCR反應(yīng)。

1.7 KLF 13基因3′UTR雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

以民豬前脂肪細胞cDNA為模板，用KLF13-F和KLF13-R引物，PCR擴增KLF13的3′UTR區(qū)?；厥諗U增片段，將目的片段插入psiCHECK-2 vector，構(gòu)建psiCHECK-2-KLF13-3′-UTR-WT（野生型）。采用重疊延伸方法突變KLF 13 基因3′UTR 區(qū)中miR-19a 結(jié)合位點，構(gòu)建相應(yīng)的突變型KLF 13 基因報告載體（見圖1）。所有構(gòu)建載體均測序驗證結(jié)果無誤。

圖1 KLF13 3′UTR序列和突變序列對比Fig.1 Comparison of KLF13 3′UTR sequence and mutant sequence

1.8 雙熒光素酶報告基因活性分析

將PK15 細胞接種至12 孔板（2.5×105個·孔-1）中，待融合至80%以上時將野生型報告載體和突變型報告載體分別與miR-19a 模擬物和NC 共轉(zhuǎn)染到PK 15 細胞，轉(zhuǎn)染后24 h，使用Promega GloMax 20/21 和Dual Luciferase Reporter AssayKit 試 劑 盒 檢測雙熒光素酶活性。試驗步驟嚴格參考試劑盒說明書操作。

1.9 油紅O染色

將誘導分化至8 d 的前脂肪細胞去除培養(yǎng)基，PBS輕洗3次，加入1 mL 4%甲醛溶液固定30 min，PBS洗3次去除甲醛，加入油紅O工作液1 mL，避光染色30 min 后，吸出工作液，再用PBS 清洗3次，使用相差顯微鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計分析

用Excel 2019處理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.0.2.236繪制圖像，由SPSS 26分析獲得統(tǒng)計學結(jié)果，采用單因素方差分析，油紅O染色脂滴計數(shù)使用image J 8.0。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。實時熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△ct法計算。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 民豬miR-19a和KLF13組織表達譜分析

為研究miR-19a 和KLF13 在民豬不同組織中表達模式，取6 月齡民豬心、肝臟、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織，實時熒光定量PCR檢測miR-19a及KLF13相對表達量。結(jié)果顯示，miR-19a在心臟和肌肉表達量最高，其次是肝臟、肺、腎和脂肪，脾中表達量最低（見圖2）。KLF13在心臟表達量最低，其次是肌肉、肝臟、脂肪、脾臟和腎臟，肺中表達量最高（見圖3）。

圖2 miR-19a在民豬不同組織表達情況Fig.2 Expression of miR-19a in different tissues of Min pigs

圖3 KLF13在民豬不同組織表達情況Fig.3 Expression of KLF 13 in different tissues of Min pigs

2.2 KLF13基因3′UTR區(qū)miRNA結(jié)合位點分析

根據(jù)TargetScan 和Ensembl 網(wǎng)站分析豬KLF13基因（NM_001011505.1）mRNA 的3′ UTR 序列。結(jié)果表明，KLF13 基因是miR-19a 的一個潛在靶基因，KLF13 基 因3′ UTR 序 列 中192～197 bp 與miR-19a 成熟序列3～9 bp 完全互補。對人、小鼠、豬、兔KLF13 基因3′ UTR 序列對比發(fā)現(xiàn)，上述物種KLF13 基因3′ UTR 均具有該保守miR-19a 結(jié)合位點（見圖4），提示KLF13 基因3′ UTR可能是miR-19a 結(jié)合位點參與KLF13 基因表達調(diào)控。

圖4 不同物種KLF13基因3′UTR與miR-19a結(jié)合位點對比Fig.4 Comparison of 3'UTR and miR-19a binding sites of KLF13 gene in different species

2.3 miR-19a 模擬物和抑制劑對KLF13 3′UTR 雙熒光素酶報告基因表達的影響

為進一步驗證miR-19a 對KLF13 基因調(diào)控作用，構(gòu)建KLF13 基因3′UTR 報告基因載體psi-CHECK-2-KLF13-3′-UTR-WT（野生型）和psi-CHECK-2-KLF13-3′-UTR-MUT（突變型），序列測序結(jié)果完全正確（見圖5）。

圖5 野生型載體和突變型載體測序結(jié)果對比Fig.5 Comparison of sequencing results of wild-type vector and mutant vector

共轉(zhuǎn)染至PK 15細胞，轉(zhuǎn)染后24 h檢測熒光強度，計算比值。結(jié)果表明，miR-19a 和WT 共轉(zhuǎn)海腎熒光和螢火蟲熒光比值與對照組對比，結(jié)果極顯著降低（P＜0.01），降低1.5 倍（見圖6）。而miR-19a與MUT共轉(zhuǎn)則對熒光比值結(jié)果與對照組相比無差異，說明miR-19a 可與KLF 13 3′UTR 結(jié)合位點結(jié)合，抑制KLF 13表達。

圖6 雙熒光素酶報告基因載體熒光強度結(jié)果Fig.6 Fluorescence intensity results of dual luciferase reporter gene vector

2.4 miR-19a 模擬物和抑制劑對內(nèi)源性KLF13 基因表達的影響

通過結(jié)合位點分析初步預測miR-19a 影響KLF13 基因表達，為進一步驗證KLF13 是否為miR-19a 靶基因，轉(zhuǎn)染miR-19a 的模擬物與抑制劑，24 h 后回收細胞，進行熒光定量PCR 檢測miR-19a 和KLF13 表達量。結(jié)果表明，過表達miR-19a 模擬物后，miR-19a 表達量極顯著提高（P＜0.01），是對照組350 倍；KLF13 mRNA 表達水平極顯著降低（P＜0.01），降低至0.3 倍。過表達miR-19a 抑制劑后，miR-19a 表達量極顯著降低（P＜0.01），與對照組相比降低至約0.2 倍；KLF13表達水平顯著提高（P＜0.05），提高至1.6 倍（見圖7）。結(jié)果表明，miR-19a對KLF13的表達具有負調(diào)節(jié)功能。

圖7 過表達及抑制miR-19a后miR-19a和KLF13表達情況Fig.7 Overexpression,miR-19a,KLF13 expression after inhibition of miR-19a

2.5 miR-19a 模擬物和抑制劑對脂肪分化標志基因表達的影響

檢測轉(zhuǎn)染誘導分化后2 d 脂肪分化標志基因，脂肪分化標志基因選取KLF13、LPL、AP2、C/EBPα、NFR1、PPARα、BRCA1和ALDH1A1。過表達miR-19a 后，KLF13、LPL、C/EBPα、NFR1、ALDH1A1表達量極顯著降低（P＜0.01），與對照組相比，分別降低至0.2、0.1、0.2、0.15、0.3倍；AP2、PPARα、BRCA1表達量顯著降低（P＜0.05），降低至0.4、0.5、0.4倍。抑制miR-19a表達后，KLF13、LPL、NRF1、PPARα 表達量與對照組相比極顯著升高（P＜0.01），分別升高1.7、2.8、10.5、1.8 倍；AP2、C/EBPα、BRCA 1、ALDH1A1 表達量顯著升高（P＜0.05），升高1.3、1.35、1.3、1.37倍（見圖8）。結(jié)果表明，miR-19a可負向調(diào)控脂肪分化標志基因表達。

圖8 脂肪分化標志基因表達情況Fig.8 Expression of adipogenic differentiation marker genes

2.6 miR-19a 模擬物和抑制劑對脂肪酸代謝標志基因表達的影響

檢測轉(zhuǎn)染誘導分化后2 d 脂肪酸代謝基因表達量，脂肪酸代謝標志基因選取RXRA、LIPE、PDGRFA 和RARB 基因，過表達miR-19a后，RXRA、PDGRFA 和RARB 表達量極顯著升高（P＜0.01），與對照組相比，分別升高2.7、2.0、1.8 倍，LIPE 表達量無變化。抑制miR-19a表達后，RXRA、PDGRFA、RARB 表達量顯著降低（P＜0.05），分別降低至0.6、0.5、0.4 倍（見圖9），而LIPE 表達量極顯著提高（P＜0.01），提高1.8 倍。結(jié)果表明，miR-19a 可正向調(diào)控多個脂肪酸代謝標志基因表達，對LIPE 調(diào)控機制尚不明確。

圖9 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達情況Fig.9 Expression of genes related to fatty acid metabolism

2.7 miR-19a 模擬物和抑制劑對前脂肪細胞成脂影響及油紅O染色鑒定

民豬前脂肪細胞轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物、抑制劑及對照后誘導細胞成脂，為保證模擬物和抑制劑持續(xù)發(fā)揮作用，間隔1 d對細胞轉(zhuǎn)染1次，誘導成脂8 d，對細胞進行油紅O 染色，結(jié)果如圖10 所示。與NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物誘導分化8 d 形成的脂滴數(shù)極顯著降低（P＜0.01），降低至105 937；轉(zhuǎn)染miR-19a 抑制劑誘導分化8 d 形成的脂滴數(shù)與NC 相比極顯著提高（P＜0.01），提高到304 818（見圖11）。結(jié)果表明，miR-19a 可負向調(diào)控民豬前脂肪細胞脂滴形成。

圖10 過表達、抑制miR-19a油紅O染色Fig.10 Overexpression,inhibition of miR-19a oil red O staining

圖11 誘導成脂油紅O染色脂滴數(shù)量Fig.11 Number of lipid droplets induced into lipid oil red O staining

3 討 論

miRNA 對基因表達具有重要調(diào)控作用。在動物中，miRNAs 通過結(jié)合目標mRNA 3′UTR 互補序列導致翻譯抑制或基因沉默[11]，許多研究表明，miRNA可促進或抑制前脂肪細胞分化[5-8]。miR-19a已被證實在肌肉細胞增殖、分化和心肌細胞增殖過程中具有重要作用[13-14]。因此在組織表達譜中，心臟組織和肌肉組織有較高表達量。

為研究miR-19a在民豬前脂肪細胞分化作用的分子機制，發(fā)現(xiàn)過表達miR-19a下調(diào)脂肪分化標志基 因 LPL、 AP2、 C/EBPα、 NFR1、 PPARα、BRCA1 和ALDH1A1 的表達。甘油三酯脂肪酶（LPL）主要由脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞分泌，在3T3-L1 脂肪細胞中，抑制LPL 表達可抑制脂肪積累[12]，C/EBPα、脂肪酸結(jié)合蛋白（AP2）、氧化應(yīng)激刺激核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，NFR1）、PPARα在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮促進作用[15-17]，Jackson 等通過誘導BRCA1 DNA 修復相關(guān)基因（BRCA1 DNA repair associated，BRCA1）降低線粒體呼吸提高脂肪積累[18],Hu 等研究結(jié)果顯示，乙醛脫氫酶1 家族成員A1（aldehyde dehydrogenase 1 family member A1，ALDH1A1）可促進脂肪分化[19]，本試驗結(jié)果說明miR-19a對脂肪分化標志基因發(fā)揮負調(diào)控作用；過表達miR-19a上調(diào)脂肪酸代謝標志基因RXRA、PDGRFA、RARB 的表達，RXRA、維甲酸受體β（維甲酸受體β，RARB），RXRA 與PPARS 結(jié)合促進糖代謝與脂代謝，RARB 和RXRA 可降低牛肌內(nèi)脂肪形成[20],Lee等通過高脂飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)小鼠中的血小板衍生生長因子受體α（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRα），PDGFR+細胞通過高脂飼養(yǎng)可增加脂肪細胞分化[21]，Taniguchi 等研究發(fā)現(xiàn)PDGRFα表達量與PPARα 表達量呈負相關(guān)[22]，本試驗說明miR-19a 對脂肪酸代謝標志基因發(fā)揮正調(diào)控作用；過表達后誘導分化8 d脂滴數(shù)量降低，反之，miR-19a 可能對前脂肪細胞誘導分化發(fā)揮負調(diào)控作用。脂肪分化標志基因和脂肪酸代謝標志基因變化趨勢與Jackson 等研究結(jié)論一致，脂肪酶E（lipase E，LIPE）通過編碼調(diào)控激素敏感脂肪酶促進脂肪積累，LIPE 在過表達時無變化而抑制時顯著升高，可能是因LIPE 主要作用是脂肪積累[23]，過表達miR-19a時僅能減少脂肪細胞分化，不能完全抑制分化，因此LIPE 與對照組相比無明顯變化，抑制miR-19a 時脂肪累計增加，LIPE 顯著提高。基于模擬或抑制miR-19a表達對成脂分化標志基因和脂肪酸代謝標志基因的調(diào)控作用及誘導8 d 油紅O 染色結(jié)果，證明miR-19a在民豬前脂肪細胞分化過程中發(fā)揮負調(diào)控作用。

通過在線軟件預測miR-19a 可能的靶基因，KLF13是miR-19a靶基因之一，生物信息學分析顯示，KLF13基因3′UTR具有保守的miR-19a結(jié)合位點，大量研究證明KLF 家族在調(diào)節(jié)脂肪細胞分化中發(fā)揮重要作用[24-25]。本試驗通過轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物或抑制劑顯著降低或提高KLF13 表達量，為進一步驗證二者關(guān)系，KLF13基因3′UTR報告基因分析和定點突變分析證實KLF13 是miR-19a 靶基因。Jiang 等研究結(jié)果表明，KLF13 通過結(jié)合PPARγ的Promotor區(qū)激活表達，促進豬脂肪細胞分化[26]，說明miR-19a可能通過調(diào)節(jié)KLF13表達調(diào)控脂肪形成。大多數(shù)miRNAs 通過與靶基因mRNA的3′UTR 不完全互補配對，抑制靶基因mRNA 翻譯，調(diào)節(jié)靶基因表達，這種作用方式影響蛋白表達水平[11]。本試驗未進行蛋白層面驗證，未來將補充過表達或抑制miR-19a后KLF13蛋白表達情況，進一步明確miR-19a對KLF13的調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本試驗發(fā)現(xiàn)，miR-19a在民豬前脂肪分化過程中發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，證明促進豬脂肪分化基因KLF13 是miR-19a 靶基因，結(jié)果為進一步研究miR-19a是否通過影響KLF13表達進而影響民豬前脂肪細胞分化提供支持，也為分析microRNA 對民豬前體脂肪細胞分化調(diào)節(jié)提供參考。